水产动物育种学 第七章 细胞融合与核移植

水产动物育种学第七章细胞融合与核移植细胞融合又称体细胞杂交或超性杂交。细胞融合－－在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞的现象。包括：1.精子和卵子的融合2.正常情况下不能进行有性杂交的异种细胞，融合成杂种细胞（hybridcell）。第一节细胞融合（cellfusion）细胞融合是六十年代发展起来的一门技术，属于细胞工程学的一个分支，为体细胞遗传学的发展开辟了道路。应用细胞融合技术，可以跨越杂交的障碍，结合不同种的优良性状。•1957年发现仙台病毒在体内和体外均引起欧利希氏腹水癌细胞的融合。1960年异种哺乳类动物细胞融合成功促使细胞融合的制剂称为融合剂。细胞融合剂主要分为病毒与化学物两大类：病毒：仙台病毒、灭活的疱疹病毒、腮腺炎病毒以及新城鸡瘟病毒等，其中仙台病毒最早用于诱导细胞融合，成为早期细胞融合技术广泛采用的标准融合剂；一、融合方法化学物：硝酸钠、聚乙二醇（PEG）、聚醋酸乙烯脂（PVA）、聚乙烯吡咯酮（PVP）、硫酸多缩葡萄糖、溶血卵磷脂、甘油、油酸盐、膜动剂（AZC），磷酸盐，脂质以及二价阳离子载体等。其中以PEG应用最广，效果最好。电融合：利用电场使细胞排列成串，并紧密接触；再使用电脉冲使细胞接触部分发生细胞膜融合。激光融合：利用激光微束破坏相邻细胞的接触区，从而导致细胞膜的融合。（诱导鱼类受精卵融合，张闻迪等，1988，1991，1992）双细胞胚胎融合前后的对照细胞融合过程需经过三个阶段（p156图7-1）1、点接触两个细胞表面结合在一起的凝集状态。其结合力不那么强，而且各个细胞保持完整的球形。2、面接触病毒/PEG等使细胞进入面接触状态。在此阶段各个细胞呈斜球形，细胞膜开始发生融合。3、融合融合过程进一步进行，则全部形成球或卵形融合细胞。二、融合细胞的筛选与鉴定荧光标记筛选：荧光抗体技术+流式细胞仪=快速分选术形态、生化或遗传标记：区别在形态\生化上具有明显特征的细胞（藻类）；利用遗传标记对筛选出的细胞株做鉴定。选择培养基筛选：利用杂种细胞特有的生化途径，使用选择培养基进行筛选。脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合：DNA合成途径1.糖与氨基酸（叶酸为辅酶），2.次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷途径。HAT培养基筛选融合细胞。9三、细胞融合技术的应用单克隆抗体的生产：外源蛋白通常会诱导脾脏的B淋巴细胞产生抗体，抗原可诱导多种B细胞合成不同的抗体。被激活的B细胞增殖产生可合成抗体的后代，称之为克隆。多种B细胞后代的细胞群，称之为多克隆。单克隆的制备需要细胞融合技术。1.B淋巴细胞2.骨髓瘤细胞11微生物育种：酵母与有益曲霉菌的杂交育种。（面包、葡萄酒等）植物育种：1972，粉蓝烟草和郎氏烟草原生质体融合。目前细胞融合技术已应用于粮油作物的再生植株上。基因定位：融合细胞染色体选择性脱落显微镜下酵母的形态人与小鼠杂种细胞中人染色体的脱落动物育种：1973年童第周使用仙台病毒诱导金鱼囊胚细胞间及金鱼囊胚细胞与欧利希氏腹水癌细胞间的融合。1984阎康利用PEG诱导鲫鱼细胞融合，1986年发现二甲亚砜可大大提高PEG的诱导效果。1986年日本学者使用PEG诱导细胞融合虹鳟三倍体，后发现高钙高PH可提高诱导效果。1986年郑瑞珍等用β－丙内脂灭活的仙台病毒促使金鱼囊胚细胞融合。做法是：卵子经人工授精，发育至高囊胚，放入4℃冰箱使发育速度延缓，备用。融合之前用尖头镊子剥去卵膜，将去膜的卵子放入盛有Holtfreter液培养皿中，然后用发圈把胚盘从卵黄上切割下来，再用移液管把胚盘转移到细胞分离液，在室温下放置2－3分钟，再用微吸管吹打，使其分散成单个的囊胚细胞，用Holtfreter液洗两次，然后挑选大小较为一致的圆形囊胚细胞，双双放在盛有β－丙内脂灭活的仙台病毒液的多孔血凝板上或96孔的培养板里。每孔两个细胞，使彼此粘连在一起。囊胚细胞的融合与体细胞一样，在37℃,15－20分钟完成融合。14鱼类细胞融合技术在遗传育种、培育新品种方面具有广阔的应用前景；也逐渐成为生物技术和细胞工程中的热点，构建杂交瘤细胞制备单克隆抗体，在鱼病的诊断和治疗方面都很有意义。第二节细胞核移植细胞核移植(nucleartransplantation)－－应用显微操作技术，将一种动物的体细胞的细胞核移入到同种或异种动物的去核（或核已灭活）卵母细胞内，并使其分裂、分化、发育成胚胎甚至成体的技术。核移植得到的个体基因型与核供体的基因型相同（克隆）。由于细胞质(线粒体)中含有少量的遗传物质，故细胞核移植所得的杂种，称核质杂种。核移植个体的性状以细胞核供体为主，部分显示出细胞质受体的个别性状（细胞质遗传）。核移植技术历程：1.早期胚胎细胞核2.胚胎发育晚期的细胞核3.成体细胞核17克隆羊Dolly一、鱼类细胞核移植我国在鱼类细胞核移植方面做出了突出的贡献。1963年童第周首次将核移植技术应用于硬骨鱼类，将金鱼和鳑鲏囊胚细胞核移入同种去核未受精卵，获得正常的胚胎和幼苗。此后40年里，鱼类核移植的研究主要集中在我国，学者们在种、属、亚科、科、目间甚至纲间进行了广泛的细胞核移植研究。（P162表7-1，7-2）1980年，童第周院士（右）成功培育出具有“发育全能性”的克隆鱼；1981年又用成年鲫鱼的肾脏细胞获得克隆鱼，这比成年体细胞克隆羊多利早了15年。童第周院士于1957年～1962年间任中国科学院动物研究所所长。以鱼类囊胚细胞为核供体的研究中，先后获得鲤鲫、鲫鲤、草团、罗非鲤、罗非金等核移植鱼。亲缘关系近的鱼类较容易获得成鱼，目以上的核移植杂交仅获得早期的胚胎。以体细胞为核供体的研究中，将鲤鱼红细胞核移植入金鱼卵，获得幼鱼；草鱼尾鳍细胞核用于核移植，获得胚胎；肾脏、肝脏细胞用于核移植得到鲫鱼和金鱼的胚胎。移核鱼F2二、鱼类核移植方法1.核供体细胞的制备2.受体细胞的制备3.移核4.核质杂种的培养提供细胞核为供体－－通常为鱼类的囊胚细胞或体细胞。去核的卵子为受体－－用鱼类成熟的卵细胞。一般可采用人工催产的方法得到。卵子在接受供体核前，先要被激活以获得发育能力。鱼卵挤入水中即被激活。两者在发育时间上要配合好，要求受体成熟卵刚产出时，供体受精卵正好发育至囊胚期，否则无法进行核移植。供体与受体配合的办法：可以用超低温保存供体囊胚细胞；用温度控制供体受精卵的发育速度。22受精后已发育到高囊胚或低囊胚的鱼卵去膜后，置于底部涂有琼脂，并盛有Holtfreter氏液的培育皿中，置于解剖显微镜下，用玻璃针\发圈切下位于动物性极的囊胚细胞团，这些细胞在2－3分钟内能分散成游离细胞。如果细胞暂时分不开，可用一支细吸管吸水后轻轻冲击它们，以帮助细胞分离。郝氏液的配方NaCl0.35gKCl0.005gCaCl20.01gNaHCO30.02g双蒸水100mlpH7.01.供体细胞的准备移核前，鱼卵需先去膜。最常用的方法是用磨尖的不锈钢镊子在解剖镜下剥开卵膜，游离出卵子。剥膜应于排卵后2－3分钟，在盛有消毒水的培育皿中进行。剥粘性卵时，一般只需一手持镊，用镊尖夹住卵膜的一处，迅速把膜撕裂，裂口越大越好；剥浮性卵时，卵膜吸水后膨胀，卵周隙很大，所以可用双手持镊，同时夹住卵膜上的一处，迅速把卵膜向外撕裂。也可用Holtfreter氏溶液配制的0.25－0.5%胰蛋白酶液软化卵膜，并在换液过程中辅于轻微的摇动，这样可使卵子从中脱出。2.受体细胞的制备用极细的玻璃微针挑去核。也有人认为，受体卵可不去核，单倍体核会在移核手术后的发育过程被排斥掉。将分离的的囊胚细胞立即用吸管移至盛有去核卵的培育皿中内备用。移核时，把盛有去核卵和分离细胞的培养皿置于解剖显微镜下，用发圈将它们拨到视野内，然后将操纵台移近解剖显微镜的一侧，调节移动上的位移旋钮和微型吸管的角度，使之对准分离的囊胚细胞，轻轻向后旋动注射器上的微分筒，该细胞随培养液被吸入管内破裂，但细胞质不能分散，应仍紧包围着其中的细胞核，否则细胞核直接与液体接触会受损伤。细胞被吸入管内的位置，以刚进行管口一小段距离为宜，以免将它注入卵时带入过多的培养液。3.移核Removalofthenucleussurroundedbyasmallamountofooplasmfromamousegerminalvesicleoocyte.TakeuchiTetal.Hum.Reprod.1999;14:1312-1317©EuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryologyOocyteintheprocessofnucleartransfer28然后用发圈拨动去核卵，使胚盘朝上，再把已吸有细胞核的吸管对准此胚盘的近中央处剌入，并把细胞核（连同核外微量细胞质一起）注入胚盘内。Agraftedoocyte(coupletofakaryoplastandcytoplast)alignedbetweentwomicroelectrodes.TakeuchiTetal.Hum.Reprod.1999;14:1312-1317©EuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology核移植操作系统鱼类核移植杂种细胞由于卵外胶膜被破坏，需在等渗的Holtfreter液中培养一段时间，然后逐渐转入低渗溶液，早期胚胎发育过后可入曝气水中培养。4.核质杂种细胞的培养三、细胞核移植技术的应用1.培育新品种——获得核质杂种2.冲破远缘杂交难以进行和杂交后代不育的屏障3.保持并复制优良个体的基因型4.产生雄核纯合二倍体5.基础研究1.培育新品种——获得核质杂种1980年，中科院动物研究所细胞遗传研究组的鲤鲫移核鱼，表现出部分父母的性状。在生长优势、蛋白质含量上超过双亲，表现出明显的优势。1981年，童第周将培养30多天的成熟银鲫的肾细胞核移入去核卵中，得到1尾性成熟的银鲫，时称“试管鱼”。这是世界第一例体细胞核移植克隆的脊椎动物。对荷包红鲤核与鲫细胞质杂交的移核鱼子一代、子二代、子三代生长趋势的观察，以及对子三代的生产性能对比试验证明，子三代比作为供体核的荷包红鲤生长速度快14.74-22.47％，养殖产量高22％，肌肉蛋白高3.78％，含脂量低5.88％。当年鱼苗即能养到商品规格，具有良好的经济效益和生产推广价值。颖鲤颖鲤是采用细胞工程技术与常规杂交技术的有机结合新的综合育种方法而获得的育种新秀，80年代培育而成的。该法是先将荷包红鲤核移入鲫去核卵，获得鲤鲫移核鱼，以鲤鲫移核鱼第二代为父本，黑龙江的散鳞镜鲤为母本杂交，其杂交种即是颖鲤。颖鲤具有生长快、含肉率高、肉质细嫩、味道鲜美、抗寒力强、容易起捕等优良性状。与其他杂交鲤相比，生长速度快30％以上，当年可达1-2公斤(长江以南地区)。当年颖鲤个体增重比父本快67％，比母本快27.1％，体内蛋白质含量比双亲高1-1.4％，可见颖鲤具有较强的生长优势和营养性能。2.冲破远缘杂交难以进行和杂交后代不育的屏障–杂交是培育新品种的方法之一，有些杂交在自然界是无法直接进行的。–比如鳑鮍鱼♀×金鱼♂在自然条件或人工受精条件下均无法进行杂交，可通过核移植却可以得到0.5%左右的幼鱼。雄鰟鮍准备排出精子3.保持并复制优良个体的基因型优良个体的基因型保持很难借助细胞核移植技术可以将这种优良的基因型保持下去（相当于无性繁殖）These19identicalmalealbinofrogswerepreparedbynucleartransplantationintounfertilizedeggsofthedarkgreenfemalefrog.(Malefrogsareabouthalfthesizeoffemales.)4.产生雄核纯合二倍体刘汉勤等（1987），通过核移植的办法得到了普通泥鳅的雄核二倍体。优点是去除隐性有害的基因，在较短的时间内得到纯系。普通泥鳅的雄核二倍体2n=48♀×2n=100♂去除受精卵的雌核泥鳅雄核、大鳞副