细菌标本片的制备及染色方法

技能训练5细菌标本片的制备及染色方法能利用不同的材料进行细菌标本片的制备掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性实训目标酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等仪器材料方法步骤（一）细菌标本片的制作（二）常用的细菌染色方法（三）常用染色液的配制（一）细菌标本片的制作1．涂片标本的制作（1）涂片（2）干燥涂片（3）固定涂片2．血液推片和组织抹片的制作（1）血液推片的制作（2）组织抹片的制作1．涂片标本的制作（1）涂片取清洁载玻片一块，用吸管吸取生理盐水1滴置于玻片中央，再将接种环在火焰上灭菌，待冷后从固体培养基上挑取少许菌落，置于玻片上的生理盐水中混均匀，并在玻片上涂成直径约为1cm的涂面，要求薄而均匀。（2）干燥涂片在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰上来回微烤使其干燥。（3）固定涂片干燥后，将涂面向上，在火焰上快速来回通过2～3次，其温度以手背接触玻片底面感觉微烫手为宜。2．血液推片和组织抹片的制作（1）血液推片的制作取一张边缘整齐的载玻片，用其一端蘸取少许血液，在另一张干净无油脂的载玻片上，以45°角度均匀地推成一薄血涂片，以红细胞不重叠为宜。（2）组织抹片的制作待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的压迹。（二）常用的细菌染色方法1．美蓝染色法2．革兰氏染色法3．瑞氏染色法1．美蓝染色法在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～3min，水洗，吸水纸轻压吸干或晾干和镜检，结果菌体呈蓝色。2．革兰氏染色法（1）在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1～3min，水洗。（2）加革兰氏碘液，作用1～2min，水洗。（3）加95％酒精脱色约30s至1min，水洗。（4）加稀释石炭酸复红，复染30s左右，水洗，吸干后镜检。结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。3．瑞氏染色法细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗，干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈其他颜色。（三）常用染色液的配制1．碱性美蓝染色液2．革兰氏染色液3．瑞氏染色液1．碱性美蓝染色液甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL；乙液：0.01%苛性钾溶液100mL先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈旧的染色好。2．革兰氏染色液（1）草酸铵结晶紫溶液甲液：结晶紫2g、95%酒精20ml；乙液：草酸铵0.8g、蒸馏水80ml将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀制成甲液，然后将完全溶解的乙液与甲液混合即成。（2）卢戈氏碘液碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵中，加入少量蒸馏水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入，再装入瓶中。（3）石炭酸复红稀释液取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10g溶于95%酒精100ml中）1ml和5%石炭酸水溶液9ml混合，即为石炭酸复红原液。再取原液10ml和90ml蒸馏水混合，即成石炭复红稀释液。3．瑞氏染色液取瑞氏染料0.1g，纯中性甘油1ml，在研钵中混合研磨，再加入甲醇60ml，使其溶解，装入中性瓶中过夜，次日过滤，盛入棕色瓶中，保存于暗处。保存越久，染色越好。课后作业1.写出实习报告；2.掌握美兰染色的方法；3.掌握革兰氏染色的方法