基因芯片与高通量DNA测序技术前景分析-基因芯片与高通量

中国科学C辑:生命科学2008年第38卷第10期:891~899测序技术前景分析滕晓坤①,肖华胜①②*①生物芯片上海国家工程研究中心,上海201203;②国家人类基因组南方研究中心,上海市-科技部共建疾病与健康基因组学重点实验室,上海201203*联系人,E-mail:[e-mail]收稿日期:2008-10-03;接受日期:2008-10-08国家高技术研究发展计划(批准号:2006AA020704)和上海市科学技术委员会(批准号:05DZ22201)资助项目摘要基因芯片与第二代DNA测序是两种重要的高通量基因组学研究技术,对于揭示基因组的结构与功能已经并正在发挥重要的推动作用.基因芯片技术建立了10多年,技术日渐成熟,在功能基因组、系统生物学、药物基因组的研究中已经得到了广泛的应用.2003年,454公司首先建立了高通量的第二代测序技术,其他公司相继推出了Solexa和Solid测序技术.虽然第二代测序技术建立的时间不长,但发展非常快,已经应用于基因组,包括测序和表观基因组学以及功能基因组学研究的许多方面.本文简要综述了基因芯片和第二代测序技术及其应用进展,并分析了这两种高通量基因组学技术的前景.关键词基因芯片第二代高通量测序技术基因组20世纪80年代启动的由多个国家参加的人类基因组计划,被称为是继曼哈顿原子计划、阿波罗登月计划之后的第三大科学计划,这个计划的完成对人类认识自身,提高健康水平,推动生命科学、医学、生物技术、制药业、农业等的发展具有极其重要的意义.2000年6月26日由美国、英国、法国、德国、日本和中国科学家同时向世界宣布人类基因组工作草图已基本完成,2002年2月又公布了“精细图”.这是基因组学研究领域的一个里程碑式的工作.随着人类基因组计划的实施,也推动了模式生物基因组的测序,在这期间还完成了大鼠、小鼠、水稻等物种的测序.众多物种的基因组序列被解开,大量的基因通过基因组测序被识别,接下来的工作是要对这些基因的结构、功能、表达和分布进行深入的研究,急需高通量、大规模的分析手段和方法来解决这些需求.20世纪90年代建立起来的基因芯片技术和最近发展起来的第二代DNA测序技术是高通量研究基因的结构和功能的两种比较重要的技术,推动了功能基因组和系统生物学研究的发展.本文简要介绍了这两种技术和应用,并对这两种技术在生命科学中的应用前景进行了分析.1基因芯片技术及其发展生物芯片的概念由Fodor等人在1991年提出[1],是指能够快速并行处理多个样品并对其所包含的各种生物信息进行解剖的微型器件,它的加工运用了微电子工业和微机电系统加工中所采用的一些方法,只是由于其所处理和分析的对象是生物样品,所以叫生物芯片(Biochip).在生物芯片技术中,基因芯片技术建立最早,也最为成熟.基因芯片,又称DNA微阵列(DNAmicro-array),是把大量已知序列探针集成在同一个基片(如玻片、膜)上[2~7],经过标记的若干靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针杂交,通过检测杂交信号,对生891滕晓坤等:基因芯片与高通量DNA测序技术前景分析物细胞或组织中大量的基因信息进行分析.其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化.高度的并行性不仅可以大大提高实验的进程,而且有利于DNA芯片技术所展示图谱的快速对照和阅读.多样性可以在单个芯片中同时进行样品的多参数分析,从而避免因不同实验条件产生的误差,大大提高分析的精确性.微型化可以减少试剂用量和减小反应液体积,降低实验费用.高度自动化则可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量.1995年Science杂志首次报道了Schena等人[8]用DNA微阵列技术并行检测拟南芥多个基因的表达水平.1994年第一张商业化基因芯片由Affymetrix公司推出.基因芯片的制备方法主要有两种：原位合成法和点样法.从目前应用的情况来看,原位合成的基因芯片的密度高,重复性好,制备过程中的质量控制比较容易,但是成本较高.而点样技术主要应用在部分没有商业化芯片的物种的基因芯片的制备,制备的成本较低.原位合成的芯片是今后的一个发展和应用方向.基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理[9],通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序,把腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种不同碱基的核苷酸按不同次序化学偶联在相应的位点,原位合成序列不同的寡核苷酸探针,形成DNA芯片.这一技术是由Affymetrix公司的Fodor及其同事最先发明的[1],他们使用含光敏化学保护基的DNA合成试剂,用光脱保护法直接在基片上合成寡核苷酸探针,即光导向原位合成法.该方法的优点在于精确性高,缺点是制造光掩蔽剂既费时又昂贵.美国Wisconsin大学的Singh-Easson等人利用计算机设计的虚拟掩模来制备DNA芯片,他们使用一种包括480000个微小铝镜阵列的光学数字微镜设备,通过计算机精确地控制光线在微镜上的反射方向,将紫外光束直接照射到玻璃基片上,从而在基片的特定区域上选择性地脱除保护基.采用虚拟掩模技术不用耗资费时去加工光掩模,降低了基因芯片的制备时间和成本[10].Nimblegen公司利用这一技术进行了高密度芯片的商业化生产.国内的东南大学生物芯片研究小组,结合组合化学合成与软光刻微印刷技术的原理,用一套组合的分子印章印刷的方式——压印的方式分配DNA合成试剂到基片的特定位点,多次压印直至指定的探针微阵列形成而制得DNA芯片.该技术利用预先制作的分子印章实现空间寻址原位合成,设计适当的合成顺序与设计凹凸位点不同的印章即可在基片上原位合成出位置和序列预定的寡核苷酸或寡肽阵列.东南大学利用软光刻原位合成法,成功得到特征位点尺寸为100μm与30μm的寡核苷酸微阵列[11].点样法制备基因芯片首先按常规方法制备cDNA(或寡核苷酸)探针库,然后通过特殊的微喷头,分别把不同的探针溶液按照预先排定的顺序逐点点在片基表面,并通过物理和化学作用使探针固定于基片表面.探针片段除了可使用寡聚核苷酸探针,也可使用较长的基因片段以及核酸类似物探针(如PNA等).点样法的优越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸或cDNA探针库,探针的长度可以任意选择,灵活性大,可根据需要自行制备.最早的点样装置是由Stanford大学的Shalon和Brown等研究人员自己搭建研制的,美国的CartesianTechnologies,TeleChem,Biodot,PerkinElmer,GEHealthcare等公司,英国的Genetix公司,中国的博奥生物公司等都有商业成型的点样机.在基因芯片制备方面除了Affyme-trix,Agilent和Nimblegen等几个公司外,大多公司普遍采用点样技术制作DNA芯片.20世纪90年代末,中国政府和科学家开始启动生物芯片的研究与开发.我国最早的一张DNA微阵列膜,是在中国科学院的人类基因组项目的支持下,利用了国家人类基因组南方研究中心所积累的大量人类cDNA克隆模板点制成功的.这张“基因芯片”成功地运用于首例肝癌及癌旁组织的比较转录组研究,其成果于2001年发表于PNAS[12].“九五”末期,国家高技术研究发展(863)计划又连续拨出专款,支持北京、上海和南京若干个课题组开始实施包括基因芯片的“生物芯片”研制工作,成立上海的“华冠”公司专门从事诊断用生物芯片的研发.国内若干民营企业也开始投入对生物芯片的研发.比较突出的包括广州“益生堂”、上海“博星”和浙江湖州的“江南生物”等企业.892中国科学C辑:生命科学2008年第38卷第10期从2000年开始,政府陆续投入近5亿元人民币,建立了北京、上海两个生物芯片国家工程研究中心,国家高技术研究发展(863)计划在“十五”和“十一五”期间对生物芯片技术的研究与产品的开发进行了重点资助,已经取得了一批重要的研究成果和开发了一批生物芯片产品.如生物芯片北京国家工程研究中心,开发了基因芯片的扫描仪,基因芯片的点样仪,杂交仪以及样品处理的仪器,形成了基因芯片的制备和应用的一套仪器设备.同时,利用自主研发的基因芯片技术平台,开发了几十种基因表达谱芯片、miRNA芯片、CGH芯片、DNA甲基化芯片以及应用于食品安全检测,临床诊断的基因芯片.生物芯片上海国家工程研究中心,建立了基于点样的基因芯片技术平台,开发了20余种基因表达谱芯片和Pathway芯片,主要的物种有人、大鼠、小鼠以及微生物全基因组芯片.同时还引进了国际上用得最多,技术也最为成熟的Affymetrix,Agilent,Illumina和Nimblegen的系统和体系,建立了严格的质量控制和应用体系,提供基因芯片的全面解决方案.承担了国家重点基础研究发展计划(973)、国家高技术研究发展计划(863)和上海市科委的项目,为国家重点基础研究发展计划(973)、国家高技术研究发展计划(863)、自然科学基金和地方政府的项目提供了技术支持和技术服务,为完成这些项目提供了技术保障.通过服务和合作在PNAS[13,14],Genomics[15,16],BBRC[17,18],JBC[19],FEBSletter[20,21]等杂志上发表了论文.2基因芯片技术的应用和发展趋势随着基因芯片技术的日渐成熟,在功能基因组、疾病基因组、系统生物学等领域中得到了广泛的应用,已经发表了上万篇研究论文,每年发表的论文呈现增长的趋势.芯片制备技术极大地推进了生物芯片的发展,从实验室手工或机械点制芯片到工业化原位合成制备,从几百个点的芯片到几百万点的高密度芯片,生物芯片从一项科学成为一项技术,被越来越多的研究者广泛运用.各个实验室不断产生海量的杂交数据,相同领域的研究者需要比较不同实验平台产生的数据,作为基于分子杂交原理的高通量技术,芯片实验的标准化、可信度、重现性和芯片结果是否能作为定量数据等问题成为所有的芯片使用者关心的课题.迈阿密原则和微阵列质量控制系列研究回答了这两个问题.迈阿密原则(MinimumInformationAboutaMicro-arrayExperiment,MIAME,微阵列实验最小信息量)提出了生物芯片标准化的概念[22],该原则的制定使世界各地实验室的芯片实验数据可以为所有的研究者共享.同时,美国国家生物信息学中心(NCBI)和位于英国的欧洲生物信息学研究所(EBI)也建立了GEO[23]()和ArryExpress()公共数据库,接受和储存全球研究者根据迈阿密原则提交的生物芯片数据,对某项研究感兴趣的研究人员可以下载到相关课题的芯片原始数据进行分析.2006年美国FDA联合多个独立实验室进行了MAQC系列实验(microarrayqualitycontrol,MAQC),旨在研究目前所使用的芯片平台的质量控制.该研究的12篇系列文章发表在2006年9月份的NatureBiotechnology上,用严格的实验分析了目前主流芯片平台数据质量[24~26],芯片数据和定量PCR结果之间的相关性[27],芯片数据均一化方法[28],不同芯片平台之间的可重现性[29,30].证明了不同芯片平台产生的数据具有可比性和可重现性,各种芯片平台之间的系统误差远远小于人为操作和生物学样品之间本身的差异,肯定了芯片数据的可信性,打消了以往对芯片数据的种种猜疑,明确了基于杂交原理的芯片同样可以作为一种定量的手段.推动了生物芯片技术在分子生物学领域更广泛的应用.生物信息学和统计学是在处理基因芯片产生的海量数据中必不可少的工具[31].随着芯片应用的推进,芯片数据分析的新理论和新算法不断地被开发出来,这些方法帮助生物学家从海量的数据里面快速筛选出差异表达的基因.一次芯片实验获得的是成千上万