网织红细胞检测进展和其临床应用

网织红细胞检测进展及其临床应用概述网织红细胞(reticulocyte，Ret)是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞，略大于成熟红细胞。网织红细胞是有核红细胞刚刚失去核的阶段，仍属未完全成熟的红细胞，浆内尚残留有嗜碱性RNA，经碱性染料（如天青B、煌焦油蓝或新亚甲蓝）活体染色后，在包体内可见蓝色点状或网状结构，故名网织红细胞。概述红细胞在骨髓中生成，至发育为成熟红细胞，经历了不同阶段：干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞，最后发育为成熟红细胞。随着细胞的成熟，RNA含量逐渐减低，至细胞完全成熟后消失或接近消失，即红细胞中网线状结构越多，表示细胞越幼稚。ICSH将Ret分为4型：Ⅰ型（丝球型）、Ⅱ型（花冠型或网型）、Ⅲ型（破网型）、Ⅳ型（颗粒型）。正常生理状态下，Ⅰ型只存在于骨髓，Ⅱ型在外周血也很难见到，Ⅲ型仅有少量释放到外周血，因此外周血网织红细胞计数时以Ⅳ型为主。概述Ret是红细胞成熟过程中的一个重要阶段，是判断骨髓红系造血情况和疗效观察的重要指标。其检测方法既有传统的显微镜目测法，又有现代化的仪器计数法(如流式细胞仪、网织红细胞计数仪及血细胞分析仪)。现对Ret的检测进展，各检测方法的优缺点及其在临床上的应用逐一讲述。网织红细胞检测进展1.手工法2.血细胞分析仪法3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪1.手工法手工法分玻片法和试管法。由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短，因此结果偏低；试管法容易掌握，重复性较好，必要时还可以从混合血液中再取标本重新涂片复查。试管法被列为手工法Ret计数的参考方法。按卫生部《全国临床检验操作规程》第2版，采用试管法用煌焦油蓝染液对血液标本进行红细胞活体染色、制片，选择细胞分布较均匀、厚薄适中的体尾交界处，每份标本油镜下参照陈宝梁的建议，即Ret6%，计数红细胞1000个；3%～5%计数红细胞2000个；1%～2%应计数红细胞4000个；小于1%计数红细胞10000个。1.手工法传统的显微镜计数方法操作较繁琐、影响结果的因素较多。近年来，国内开始使用国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的Miller窥盘进行计数，规范了计算区域，减少了实验误差，使结果准确性有所提高(卫生部临检中心建议，CV控制在15%之内)。Miller窥盘法是将一种光学圆片状Miller窥盘安放在显微镜目镜中，窥盘中有面积比例为1：9的2个正方形计数方格，只需计数1／9小方格内的红细胞即可准确估量出整个大方格内的红细胞数量。卫生部临床检验中心控制Ret计数CV≤15%需镜检的RBC数目Ret(%)计数Miller窥盘小方格RBC相当于缩视野法计数RBC数目1-244440003-52222000611110001.手工法国内很多学者在此基础上设计了几种改良的Ret计数窥盘。张时民等设计了一种双环式结构的Ret计数窥盘，该盘的特点是小圆环和大圆环面积之比为1：10，小圆环为计数红细胞数量，大圆环为计数Ret数量。其圆形结构更加适合于人们观察和计数显微镜下细胞数量的习惯，而且此比例更加易于计算红细胞和Ret的比值。1.手工法陈高远则在这两种窥盘的基础上设计了改良式Miller窥盘，采用双正方形结构，小方格和大方格之比也达到1：10，只是将红细胞计数区域位移至中心部位，以方便红细胞数量的计数。1.手工法刘志贤设计了一种新的Ret计数窥盘即180×4扇形Ret计数窥盘：圆形直径为19mm，圆心角∠AOB=∠COD=∠EOF=∠GOH=180。弧AB=CD=EF=GH=180。计算公式为：Ret%=整个计数区域内的Ret数／(4个小扇面区域内的RBC总数×5)×100％。这种新型Ret计数窥盘4个扇形区域均匀分布在整个视野的4个方向，4个扇形面积之和是整个圆形面积的1／5，因此在理论上基本解决了红细胞分布不均匀引起的问题，降低了系统误差和随机误差。手工法网织红细胞活体染色染料评价染料评价新亚甲蓝WHO推荐使用，对RNA着色强，试剂稳定，Hb几乎不着色煌焦油蓝溶解度低，染料沉渣易附着红细胞表面，影响辨认；易受变性珠蛋白小体、HbH包涵体干扰中性红染液浓度低、背景清晰、网织颗粒与红细胞对比鲜明；不受变性珠蛋白小体、HbH包涵体干扰2.血细胞分析仪法1993年以来，可进行Ret计数的血细胞分析仪相继问世，因其具有重复性好、准确度高、省时等优点，正被越来越多的医院所采用。仪器法Ret计数使用各种荧光染料和非荧光染料对Ret进行染色，采用鞘流技术和射频技术等不同原理进行检测。血细胞计数仪不仅可以计数Ret，同时还能检测出网织红细胞绝对值Ret#、网织红细胞平均体积(MRV)、网织红细胞成熟指数(RMI)等许多参数，这些参数是Ret分析、临床应用和研究的热门领域。2.血细胞分析仪法统计表明，仪器法测定Ret精密度有明显提高：对低Ret标本，CV值在10%～21%之间；对正常范围的标本，CV值在3%～16%之间；高值标本，CV值在2%～10%之间。2.血细胞分析仪法虽然仪器法Ret计数有诸多优点，而且精密度明显优于手工法，但也存在一些不足：第一，所有仪器分析的基本原理都是检测Ret内RNA的存在量来决定其百分率和绝对值，当某些患者血液中有核细胞或淋巴细胞异常增加时，可导致Ret计数结果的假性增加；第二，冷凝集素存在、红细胞的聚集、某些病理因素或药物都能使红细胞产生自身荧光；第三，自动化分析仪结果的准确性除了依赖于仪器本身的良好性能外，还应有良好的质控物随时检测仪器的状态。另外，仪器成本高、价格贵，基层医疗单位投入较为困难。3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪流式细胞仪(flowcytometry，FCM)是一种多用途的精密分析仪器，应用派若宁、吖啶橙、噻唑橙等这些特殊的荧光染料与Ret中的RNA结合，当FCM发出的激光照射于细胞上时，根据细胞能否发射出特定颜色的荧光，通过单参数定量测定RNA，从而精确测定Ret占成熟红细胞的比率。还可根据激光照射后发射出的荧光强度，或光吸收量大小、光散射量多少等参数的比例关系对Ret成熟程度进行分群，将其划分为低荧光强度网织红细胞(LFR)、中荧光强度网织红细胞(MFR)、高荧光强度网织红细胞(HFR)。3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪FCM测定精密度明显高于手工法3～6倍，可在数秒中检测20000个以上的红细胞，如Ret在1.7％～6.6%，其平均CV值在4.3%。不足之处，流式细胞仪计数Ret受HOWELL－Jolly小体、疟原虫和血小板等干扰。网织红细胞计数方法学评价检测方法评价普通显微镜法简便、成本低，可直观细胞形态；影响因素多，重复性差玻片法水分易蒸发，染色时间短，结果偏低试管法易掌握，重复性较好，易复查Miller窥盘计数法规范计算区域，减少了实验误差，ICSH推荐方法仪器法检测细胞多，精密度高，与手工法相关性好，易标准化。仪器贵；受H-J小体、有核红细胞、血小板等干扰网织红细胞检测的临床应用Ret计数及其各种参数(IRF、RMI、MRV、RPI等)在贫血的诊治、骨髓移植、肿瘤的放化疗和药物疗效检测等方面具有重要参考价值。1．网织红细胞计数的应用贫血的恢复是通过骨髓释放红细胞生成素(EPO)完成的，Ret增加可被看成是骨髓造血功能对贫血的正常反应。失血性贫血时患者Ret各项指标会显著增高，失血5～10d内Ret可达高峰，出血停止后2周可恢复正常，临床上可应用此参数和特点来判别出血是否停止；缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血时也可见患者Ret轻度增加。Ret降低主要和造血功能减低有关，典型病例为原发性再生障碍性贫血、溶血性再生障碍性危象；此外还有急性白血病、继发性再生障碍性贫血、化疗和放疗引起的骨髓造血功能抑制或减退等。2．网织红细胞生成指数(RPI)的应用RPI代表网织红细胞的生成相当于正常人的多少倍。不同生理、病理情况下，Ret从骨髓释放人外周血所需时间不同，故Ret计数值不能确切反映骨髓红细胞系统造血功能，还应考虑Ret生存期限。通常Ret生存期限约为2d，若未成熟网织红细胞提前释放入血，Ret生存期限将延长，为了纠正网织红细胞提前释放引起的偏差，用RPI来反映Ret生成速率。2．网织红细胞生成指数(RPI)的应用RPI=RET%×被测HCT/正常人HCT×1/RET成熟天数。释放入外周血的网织红细胞越趋于幼稚，其成熟时间越长。由于网织红细胞体积大于成熟红细胞，大量网织红细胞的提前释放在某种程度上影响血细胞比容的测定结果。经观察，网织红细胞成熟时间与Hct存在下列关系HCT0.39-0.450.34-0.380.24-0.330.15-0.23﹤0.15Ret成熟时间(d)11.52.02.53.02．网织红细胞生成指数(RPI)的应用RPI在估计红细胞生成有效性和贫血起因的分类方法中起到重要作用。Kinetic等应用RPI较为准确地表达出Ret的成熟状态，从而对贫血的类型进行划分，如健康者平均RPI为1，当RPI≥3时表示红细胞生成增加，如溶血性贫血和治疗后的营养性贫血；而RPI≤2时为红细胞生成减少，如缺铁性贫血；对于EPO缺乏、无效造血等情况时，RPI多在2～3之间，Kinetic法则还无法确定。3．网织红细胞成熟度(IRF)的应用IRF为不成熟的Ret与总Ret的比值，健康者平均值为0.22，参考范围0.1～0.38，IRF越大表示不成熟的Ret的数量越多。这种幼稚Ret水平的改变一般比患者HGB、血小板、白细胞和临床症状的变化出现更早。IRF和HFR的增高在很多白血病患者化疗中是与粒细胞反应一致的指标和骨髓移植后恢复的第一信号。IRF与Ret#和RPI呈一弱的、显著的正相关：IRF增加(≥0.23)，一般伴有Ret#增加，提示患者对于贫血有足够的红系反应；若IRF＜0.23，且RPI≤2，则说明红系造血活性下降，则以慢性肾功能不全居多；Ret#正常或略低，RPI≤2，但IRF≥0.23，见于急性感染、镰状细胞性贫血危象、妊娠和MDS等状况。IRF是评价贫血红系增生活性的一项新的有用的指标，IRF结合Ret#和RPI可以为进一步阐明贫血分类提供有价值的信息。4．网织红细胞成熟指数(RMI)的应用该参数是计算参数，可由仪器自动计算，也可将仪器测定的Ret分群参数经过人工计算得到。计算公式为：RMI=(MFR+HFR)／LFR×100%。文献报道RMI的参考范围，男性：17%～37%，女性：16%～35%。据报道，急性白血病化疗后Ret#正常而RMI较高，化疗中则Ret#和RMI都低；出现溶血危象时Ret#和RMI都高；ITP则Ret#正常而RMI较高。5．网织红细胞分群的应用⑴LFR和HFR可作为贫血鉴别诊断的初筛指标。研究表明，溶血性贫血(HA)患者由于骨髓造血功能活跃，大量新生的Ret释放到外周血，导致Ret、LFR和HFR明显增高；。肾性贫血时HFR上升，LFR下降而Ret变化不大；缺铁性贫血患者铁剂治疗前，Ret无明显改变，HFR轻度增高，铁剂治疗一周后，Ret及HFR可呈中度增高，因此两个参数可作为缺铁性贫血患者铁剂治疗后的疗效观察指标；再生障碍性贫血(AA)患者外周血Ret中度减低，而HFR中度增高，这种现象可能反映了AA患者造血功能紊乱时的红细胞生成变化；在鉴别诊断MDS方面，MDS患者产生的大量生存期延长的“幼稚”的Ret是导致HFR增加的原因。5．网织红细胞分群的应用⑵HFR和MFR+HFR可作为骨髓移植、化疗的监测指标，尤其是MFR+HFR的变化可以作为评价肿瘤患者化疗期间检测骨髓造血功能受抑制和开始恢复的较敏感指标。文献报道，骨髓移植后血小板、中性粒细胞、白细胞、Ret及目测法Ret计数恢复的天数分别为16.4、16.8、16.2、13.7、14.8d。