cDNA全场扩增

cDNASynthesisAndGeneCloning金萍南京师范大学生命科学学院动物遗传资源研究所RNA提取PCR扩增cDNA合成浓度（C）和纯度（A260/280）检测cDNA扩增流程RNA保护试剂凝胶回收DNA设计特异引物组织样品PCR法筛选阳性克隆设计引物纯化的DNAExpresssequencetag，ESTRACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）技术进行基因cDNA全长扩增文昌鱼LITAF基因全长的克隆5’RACELITAF基因中间片段3’RACELipopolysaccharide-InducedTNFFactor总RNA抽提所有接触总RNA的试剂、器材等（包括配试剂用的H2O）均经0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水处理，玻璃器皿于180℃烘箱烘烤6-8小时。提取总RNA按mirVana™miRNAIsolationKit（Ambion公司）说明书于超净台中操作（如图），提取的RNA分取部分进行纯度和完整性检测，其余于-80℃保存。安全柜总RNA提取过程总RNA的浓度和纯度检测总RNA的完整性检测琼脂糖凝胶电泳检测得到两条清晰的谱带，分别为28S和18S。说明提取的总RNA完整性好，可进行下游实验操作。28S18SLITAF基因中间片段的克隆cDNA模版的合成1）RNA2）oligodT引物、random引物3）反转录酶（M-MLV……）4）RnaseInhibitor5）dNTP6）H2O引物设计可以根据数据库中已有数据设计特异性引物或基因不同物种中的保守结构域设计兼并引物一般引物的长度为18-30bp，常用的长度为20-24bp，过长或过短都不合适。引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物所对应模板序列的Tm值最好在50-70℃之间，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。PCR法进行中间片段的扩增以反转录好的cDNA作为模板，利用合成好的特异性引物或兼并引物进行中间片段的扩增。切胶回收克隆转化挑取单菌落菌落PCR检测公司测序测序结果的分析去载体获得克隆片段将测序得到的片段与用来设计引物的片段进行比对进一步验证克隆得到的基因是否为目的基因根据blast的结果初步确定克隆的基因为自己的目的基因，该基因片段接下来用于RACE引物的设计RACE的基本概念cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。3’RACE和5’RACE常用的RACE试剂盒Ambion（FirstChoice®RLM-RACEKit）Invitrogen（GeneRacerTMKit）TaKaRa（3’-FullRACECoreSetVer.2.0and5’-FullRACEkit）Clontech（SMARTer™RACEcDNAAmplificationKit）3’RACE原理示意图试剂盒中的接头与引物3’-RACE：3'-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。3’RACE引物的设计确定读码框的方向Outer引物Inner引物RACE引物设计的要点23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。3’RACE的扩增3’RACE504bp切胶回收克隆转化挑取单菌落菌落PCR检测公司测序3’RACE序列的分析将测序得到的结果去载体与接头接下来，将3’RACE结果与中间片段采用DNAMAN软件进行拼接点击此图标进行序列拼接点击此处输入需要拼接的核酸序列点击此处开始进行拼接点击“导出”按钮输出拼接好的序列介绍常用的5’RACE试剂盒Ambion（FirstChoice®RLM-RACEKit）Clontech（SMARTer™RACEcDNAAmplificationKit）5’-RACE试剂盒一般基于以下几种技术：SMART、Oligocappingmethod、self-ligation和anchoredPCR。SMART法该技术是基于以下两个观察发展起来的：a、不同反转录酶包括MMLV合成的cDNA3’端保真度不高；b、不同的反转录酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端加上3-4个dCTP。该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全长分子的比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。Oligocapping法碱性磷酸酶烟草酸性焦磷酸酶Oligocappingmethod方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-FullRACEkitD315）和Ambion（FirstchoiceRLM-RACEkitAM1700）两家都有生产。5’RACE的扩增切胶回收克隆转化挑取单菌落菌落PCR检测公司测序5’RACE414bp5’RACE序列的分析将测序得到的结果去载体与接头接下来，将5’RACE结果与中间片段以及3’RACE片段采用DNAMAN软件进行拼接Endtoend实验在采用DNAMAN软件将克隆得到的中间片段、3’RACE片段以及5’RACE片段进行拼接后，我们还需要在序列结合处的两侧设计引物，进行endtoendPCR，以确保所获得的序列是真实存在的，同时所设计引物的位置最好在开放阅读框的两侧。同源序列比对分析RACE技术的关键环节RACE技术的关键环节：1.RNA的质量2.RACE的引物存在的问题及解决办法反转录1.RNA的质量有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。2.反转录提前终止模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免已解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。RACE的应用RACE技术主要是应用于对全长cDNA序列的获得，但对该技术进行一定的修改后，也可在其它方面显示出极高的应用价值。一、RACE技术可用于cDNA文库的构建及筛选。二、应用RACE克隆已知片段的旁侧内部序列(neighboringinternalsequence)。Fritz等(1991)以及Struck等(1994)分别用该法获得了3’端和5’端的旁侧序列。RACE的应用三、RACE可用于克隆同源基因的同源片段，为寻找同源基因提供了一种手段。总之,随着RACE技术的不断改进和完善,优化PCR扩增的条件以提高扩增的效率和忠实性，RACE技术必将在基因克隆以及基因家族和基因表达变化等研究中发挥极大的作用。