噬菌体展示技术及其应用

噬菌体展示技术及其应用高建明噬菌体是细菌病毒,在与宿主细胞特异性受体结合并注入其DNA后,能将其DNA整合进宿主基因组(溶原性),或用于合成新的噬菌体颗粒。在真核宿主中,噬菌体不能复制,如无合适的原核宿主,噬菌体如同无生命的颗粒性抗原。噬菌体可以是单股DNA(如M13、fd和f1)、双股DNA(如λ噬菌体)、双股RNA(如f6)或单股RNA(如MS2和QB)。噬菌体在自然环境中普遍存在,数量和种类远多于细菌。噬菌体展示技术（PhageDisplaytechniques，PDT）起源于1985年,是一种用于筛选和改造功能性多肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、基因克隆等多个分子生物学领域。目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。噬菌体展示的基本原理在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。SmithGP.Filamentousfusionphage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedantigensonthevirionsurface.Science,1985,228:1315-1317.1985年Smith首次通过基因工程的手段,将外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术。1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋白g融合展示在噬菌体表面,建立了噬菌体展示随机肽库。ScottJK,SmithGP.Searchingforpeptideligandswithanepitopelibrary.Science,1990,249:386.Theapplieduseofbacteriophagesphagetherapy(useasanti-bacterialagents)phagedisplayphage-deliveredvaccinedeliveryvehiclesforgenetherapytypingofbacteriaExampleofasuccessfulphagetherapytreatment.Lyticphagesspecificallykillpathogenicbacteriaasanalternativetoantibiotics接受过噬菌体治疗的病人对细菌和病毒感染的抵抗力增强,噬菌体能上调感染病人的免疫应答。噬菌体治疗能改变血清α肿瘤坏死因子(TNF-α)水平,体外加入噬菌体能提高血细胞培养物中的TNF-α和白细胞介素6水平。IL-6涉及Th2型应答,对诱导B细胞分化成抗体形成细胞特别重要。总之,这些结果表明噬菌体能作为细胞和体液免疫的天然佐剂。Inphagedisplay,aheterologouspeptideorproteinisdisplayedonthesurfaceofthephagethroughtranscriptionalfusionwithacoat-proteingene,producingnovelphageparticlesthathaveavarietyofpotentialuses.Foreignproteinscanusuallybedisplayedonmorethanonephagecoatproteinandinvaryingamounts.Generally,thesmallertheforeignproteinorpeptidethemorecopiescanbedisplayed,althoughthisalsodependsonthephageused,thecoatproteinandtheantigendisplayed.Examplesofsomemethodsthathavebeenusedtofuseforeignproteins/peptidestothesurfaceofbacteriophage.Phageshavebeenusedaspotentialvaccinedeliveryvehiclesintwodifferentways:bydirectlyvaccinatingwithphagescarryingvaccineantigensontheirsurfaceorbyusingthephageparticletodeliveraDNAvaccineexpressioncassettethathasbeenincorporatedintothephagegenome.PhagevaccinationExamplesofwaysinwhichphagehavebeenusedtodelivervaccinesWholebacteriophage(‘phage’)particles,ratherthanpurified‘naked’DNAhaverecentlybeendescribedashighlyefficientDNAvaccinedeliveryvehicles.ClarkJR,MarchJB.Bacteriophagemediatednucleicacidimmunization.FEMSImmunolMedMicrobiol2004;40:21–6.MarchJB,ClarkJR,JepsonCD.GeneticimmunisationagainsthepatitisBusingwholebacteriophageparticles.Vaccine2004;22(13–14):1666–71.Bacteriophagevaccines:cheap,extremelystable,easytoproduce,permitthecloningofrelativelylargeinserts(upto20kbforlambdavectors)donotrequireantibioticresistance,unabletoreplicateineukaryoticcells.Stabilityofλ-gt11afterdilutioninwateratambienttemperature.Twodifferenttypesoftapwaterandonebatchofdistilledwaterweretested.Stabilityofλ-gt11phageafterstoragefor24hinSMbufferatdifferentpHvalues,storedatambienttemperature.Stabilityofλ-gt11phageafterstoragefor5minSMbufferatdifferentpHvalues,storedatambienttemperature.目前，能用于蛋白质/多肽展示的噬菌体系统有丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。T7噬菌体基因组由39936bp双链线性DNA组成，有160bp的突出末端。T7噬菌体衣壳蛋白通常有2种形式，10A（344氨基酸）和10B（397氨基酸），10B是在10A的341个氨基酸的翻译框中产生的(translationalframeshift)，约占衣壳蛋白的10%，功能性衣壳或者由10A、或者由10B、或者由10A和10B以一定比例构成，这说明T7衣壳蛋白能够容纳变异体。独特的10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面，所以被用作噬菌体展示。不像丝状噬菌体系统，展示在T7表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广。T7展示系统可以高、中、低拷贝地展示不同分子量的蛋白质，是目前最为理想的展示系统。T7PhagedisplayvectorfeaturesT7selectsystem,Novagen,GermanyVectorCloningRegionsOfT7Select10-3b与传统的质粒DNA疫苗相比,利用噬菌体展示技术研制基因工程疫苗具有独特的优势：噬菌体传递的DNA疫苗诱生的抗体应答持续时间更长,滴度更高；噬菌体有强的免疫原性，是天然的免疫佐剂；噬菌体疫苗在对核酸酶的稳定性方面的优势明显，而且噬菌体疫苗能直接靶向抗原提呈细胞，使用比质粒DNA疫苗低得多的剂量就能诱发很好的免疫效果。噬菌体展示技术在制作疫苗方面的优点还体现于甚至在病原体不够确定、极度危险或不易获得的情况下,如研制SARS(又称“非典型肺炎”)疫苗,同样可通过获得特异性抗病原体抗体进行肽库筛选,设计有效、特异、安全的模拟肽疫苗。由于该技术日趋成熟,能够大规模、高通量地筛选,可为研制疫苗节省大量时间,具有抗烈性传染病疫苗设计的巨大优势。Bastien等根据呼吸道合胞病毒信息,构建了展示保护性表位(糖蛋白G)的噬菌体,在小鼠模型中,腹腔注射展示这种疫苗肽的丝状噬菌体后,可保护小鼠免受病原体的攻击。对HIV-1gp120V3环多肽展示噬菌体的研究也得到同样结果。RiemerAB,HantuschB,SponerB,etal.High-molecular-weightmelanoma-associatedantigenmimotopeimmunizationsinduceantibodiesrecognizingmelanomacells.CancerImmunolImmunother,2005,54:677–684FangJB,WangGY,YangQ,etal.ThepotentialofphagedisplayvirionsexpressingmalignanttumorspecificantigenMAGE-A1epitopeinmurinemodel.Vaccine,2005,23:4860–4866LazoL,HermidaL,ZuluetaA,etal.ArecombinantcapsidproteinfromDengue-2inducesprotectioninmiceagainsthomologousvirus.Vaccine,2007,25:1064–1070HerrmannS,LeshemaB,LobelL,etal.T7phagedisplayofEp15peptideforthedetectionofWNVIgG.JournalofVirologicalMethods,2007,141:133–140噬菌体展示疫苗十分有希望,但其技术存在一定的内在的限制性,例如,在传递噬菌体衣壳蛋白-疫苗肽融合体时,不是所有的构象活性表位都能被保留下来？此外，噬菌体生长于原核细胞，因此噬菌体疫苗将缺少真核细胞翻译后的糖基化信号。Phagesfortargetedgene-deliveryPhageshavealsobeenproposedaspotentialtherapeuticgenedeliveryvectors.Althoughconceptuallydifferent,therationaleforusingphagesforthispurposeissimilartothatforusingphagesforDNAvaccinedelivery–thephagecoatprotectstheDNAfromdegra