细胞DNA倍体分析技术在妇科检测中的应用(齐齐哈尔)

细胞DNA倍体分析技术在妇科肿瘤检测中的应用厦门麦克奥迪医学检验所厦门现代病理诊断中心罗晶内容简介细胞DNA倍体分析技术原理细胞DNA倍体分析技术在宫颈癌检测中的应用细胞DNA倍体分析的其他应用临床取材及报告解读癌症病因探讨——染色体倍体理论在所有已知的肿瘤中，承载着数千个基因的染色体伤痕累累—复制失常、屡屡断裂、结构重排甚至整体缺失。越来越多的证据显示，染色体的混乱状态并非恶性转化的副作用，而是癌症发生的直接原因和推动力。染色体数目与结构的改变足以引发某种癌症，而单个基因的突变则没有如此强大的力量。彼得·迪斯贝格（PeterDuesberg）发表于2007年《环球科学》杂志第6期“医药·科学”栏目染色体整倍性出现在正常、炎症、化生以及增生的细胞染色体非整倍性出现在几乎所有癌细胞癌症是一种DNA的疾病：非整倍体程度加重，蛋白质合成紊乱，细胞呈现恶性特征，出现形态改变和异常增殖，最终形成肿瘤。检测细胞DNA的改变是监测肿瘤发生发展最有效手段首先是细胞DNA改变（非整倍体细胞）细胞内DNA异常到一定程度出现细胞形态改变肿瘤发生的机理DNA筛查健康体检应用可应用于包括肺癌、口腔癌、宫颈癌、膀胱癌等体检筛查。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一DNA技术应用于宫颈癌检测宫颈癌致病及高危因素行为因素--过早性行为，多性伴侣，性紊乱生物因素--病毒因素：HPV（Humanpapillomavirus，人乳头状瘤病毒）感染,HSV感染,MCV感染等--宿主因素：性传播疾病(Sexuallytransmitteddiseases，STDs)，免疫系统水平低下，服用复合避孕药等--环境协同因素遗传易感性宫颈癌筛查历程巴氏涂片液基薄层制片形态学+辅助诊断方法TCT(膜式）LCT(沉降）LPT(界面化学）计算机图像分析（DNA倍体）形态学诊断HPV检测其他…GeorgeN.Papanicolaou（1883-1962）巴氏检查——最早的防癌检查巴氏涂片有50余年的应用历史，用取材器从宫颈上皮的移行区采取标本并涂于玻片上，细胞经巴氏染色后镜下观察形态液基细胞学和巴氏涂片意大利临床试验–22466:巴氏涂片–22708:液基细胞学–≥CIN2•Sensitivity（敏感性）相等•Specificity（特异性）降低–CIN1•敏感性提高RoncoG,etal,2007.BMJ液基解决了制片问题，但不能从根本上降低漏诊和误诊传统诊断细胞学的局限性•制约细胞学诊断质量的客观因素1.来自送检临床方面的因素；2.来自标本制作技术方面的因素。•制约细胞学医生诊断质量的主观因素1.经验及主观认识上的差异；2.疲劳等其他因素。形态学的补充方法探讨简单、经济、高效…子宫颈癌是目前唯一病因明确的癌症，HPV感染是宫颈癌及其癌前病变的最主要病因。HPV：200多种亚型,根据其致癌性的大小分为两类：低危型：HPV6，11，42，43，44等，常引起外生殖器湿疣等良性病变。高危型：HPV16，18，31，33，52，58，等，与宫颈癌及其癌前病变有关。一、HPV人乳头瘤病毒——《妇科细胞病理学诊断与临床处理》赵澄泉、杨敏HPV感染是自限性疾病，大部分感染HPV病毒的病人可以自愈，只有极少数发展为宫颈癌；——70%以上的感染人群在30个月内自愈，感染人群中致癌率不足1%。HPV感染与宫颈癌发病率ASCCP指南：细胞学正常的HPV感染率二、细胞DNA倍体分析（计算机辅助诊断技术）通过DNA病变检测早期肿瘤细胞，是一种定量的检测技术。2009年获得中华医学会病理学分会认证。采用细胞DNA倍体分析系统检测进行细胞扫描。分析其染色情况，具备准确、客观、简便、高效的特点。原位癌和浸润癌的癌细胞巴氏：第一个建议通过测量细胞核DNA含量检测肿瘤细胞细胞DNA倍体分析检测与HPV检测的区别HPV-DNA检测HPV病毒感染和患病风险；细胞DNA倍体检测体细胞的DNA含量，DI2.5（细胞DNA含量＞5C）即为病变细胞。正常宫颈细胞的恶性转化1.HPV-DNA整合到细胞核DNA上2.病毒蛋白E6/E7干扰中心体合成3.纺锤丝缺陷4.最初的，较少的非整倍体细胞5.进一步，严重的非整倍体细胞6.恶性转化HPV-16E6/E7：中心体数目异常HPV-16OnkoproteinsE6/E7:WrongNumberofCentrosomesE7:由于错误的中心粒导致中心体加倍出错E6:多余的中心体导致有丝分裂呈现多极化并产生异倍体DuensingundMünger:Humanpapillomavirusesandcentrosomeduplicationerrors:modelingtheoriginsofgenomicinstability.Oncogene21,6241-6248(2002)HPV检测与DNA倍体分析的对比检测对象液基标本或宫颈分泌物检测时间：2-6h临床意义：病毒检测。阳性代表为病毒感染和患病风险。检测对象液基标本检测时间：5小时左右临床意义病变检测。阳性说明有病变细胞。死亡癌前5-10年癌症宫颈癌病变时间历程高危型HPV感染细胞核DNA改变细胞形态出现变化检测方法检测靶标检测意义特点巴氏涂片/液基细胞学宫颈上皮细胞提示宫颈细胞已发生的病变情况形态学，定性检测，敏感性低HPV病毒检测HPV病毒DNA提示是否有高危病毒感染敏感性高，特异性低细胞DNA倍体检测细胞DNA异倍体提示早期细胞病变敏感显著高于巴氏涂片，特异性高于HPV几种常见宫颈癌检测方法比较各种肿瘤检测技术体细胞基因突变体细胞染色体紊乱蛋白表达改变细胞增殖分化异常细胞形态改变癌PCR基因芯片FISH、核酸原位杂交DNA-ICM（定量）FCM(流式)ELISA、免疫细胞/组织化学、Western、胶体金/荧光标记、生化检测HPV（宫颈癌）常规细胞学、组织学组织学、影像学致癌因素作用Step1：对细胞标本进行特殊染色（DNA特异性染色）Step2:：自动扫描，收集标本片上所有细胞细胞DNA定量（倍体）分析流程step3:分析扫描数据（细胞核DNA倍体变化）DNA报告（阳性）异倍体峰增生细胞≥10%DNA倍体异常细胞（DI≥2.5）正常细胞为参照细胞，DI=1（2C）扫描数据中，DI值＞2.5（倍体大于5C的）的细胞为倍体异常细胞，其DI用红色显示；DI值在1.25-2.5之间时（倍体2.5C-5C)，他们既可能是病变的，也可能是处在有丝分裂周期中；DI＜1.25（倍体2.5C以下时），扣除系统误差，它们通常是静止期分化成熟的细胞。2c4c3c6c8c1c细胞周期中的2倍体细胞或G0期的非整倍体细胞G2(分裂期)的二倍体细胞或3倍体的增殖细胞G0期的2倍体细胞(witherrors)2c4c3c6c8c1c5c当DNA含量5c（DI=2.5)，超过了正常细胞分裂的倍体变化，应考虑为异常细胞DNA-ICM直方图示意DNA异倍体情况diploidPolyploid多倍体Aneuploid异倍体Dipolid二倍体阳性DNA报告的结果判读DNA倍体与其他检测技术结合•TBS+细胞DNA倍体•HPV+细胞DNA倍体？DNA定量分析+细胞形态学联合诊断有效提高检测阳性率，减少漏诊地区组织单位筛查技术细胞学结果筛查总人数细胞学异常细胞学异常之组织学结果≥CIN2CIN1正常（慢性宫颈炎）上海上海交通大学附属仁济医院新柏氏TCT﹥ASCUS62941011620441.60%20.00%25.00%55.00%云南曲靖国际和平妇幼保健院新柏氏TCT6116130714242.12%15.56%31.11%53.33%广州南方医科大学南方医院新柏氏TCT610713982362.27%69.49%30.51%厦门两癌筛查TBS+DNA倍体DNA≥38155625543393806203.13%25.32%28.40%46.30%2012年全国妇科年会妇科肿瘤分会数据对比统计学分析各种筛查技术发现CIN2+病变的灵敏度和特异度筛查方法类型/原理灵敏度*特异度*备注*HPV-DNA检测HC-280%～98%61%～95%9(1356～8497)PCR75%～89%790%～96%3(1995～4761)*细胞学Papsmear37%～84%87%～98%12(1356～11085)*液基细胞学（LBC）69%～88%81%～97%3(744～8489)DNA倍体分析DNA-ICM94.84%98.76%1(132327)联合筛查DNA-ICM,LBC98.28%98.65%1(132327)HC-2，Papsmear86%～100%76%～95%5(1356～20810)*HC-2,LBC92%93%1(1997)PCR,LBC91%88%1(8551)注：引自Cervixcancerscreening,IARCHandbooksofCancerPrevention,IARC2005HPV-DNA和DNA异倍体HR-HPV感染与宫颈癌的发存在必然关系，但人群中HR-HPV感染率较高，且大多数HR-HPV感染为暂时性的可自行恢复，尤其是年轻女性。只有持续性感染导致宿主细胞病毒癌基因E6、E7高表达，最终引起多倍体和非整倍体细胞出现，才会导致宫颈癌的发生。因此，正常的DNA倍体分布可能是短暂的HPV感染和复原的信号。而异常的DNA倍体分布则暗示持续的HR-HPV感染。有研究证明，HR-HPV感染与出现DNA含量大于9C细胞的不典型鳞状细胞直接相关，而且不管细胞学检查的结果如何，9C细胞的出现联合HR-HPV感染可以有效预测宫颈疾病的发展。基于宫颈癌流行病学的研究成果和肿瘤生物学特征，DNA倍体分析联合HR-HPV检测预测宫颈CIN可以有效地提高CIN的检出率。---BoeckingA.etal.CancerCytology.2004,102对于细胞学为ASCUS或LSIL,而无DNA异倍体的病例,建议其定期复查,阴性预期值为95%对于细胞学为ASCUS或LSIL,有DNA异倍体,2个月后检测出CIN3以上病变的阳性预期值为46%。DNA-ICM在妇科肿瘤检测中的其它应用（一）典型病例随访•叶某某，女，33岁，福建漳州某医院时间细胞学DNA定量分析活检2011.3阴性阴性2012.4阴性可疑（4-6个月复查）2012.7提示细菌性阴道病阳性（建议活检）慢性宫颈炎伴CINⅠ-Ⅱ级，2012.9阴性可疑（4-6个月复查）2013.2ASCUS阳性（建议活检）慢性宫颈炎伴CINⅡ级,累及腺体•2013年2月第五次检查结果：宫颈细胞学诊断为意义不明确的非典型鳞状上皮细胞，细胞DNA定量分析可见5个DNA倍体异常细胞，建议临床阴道镜检查和活体组织检查，活检取4个点位，诊断为慢性宫颈炎伴CINⅡ级。DNA-ICM的应用（二）恶性程度的评估DNA异倍体在不同分化程度的鳞状细胞癌中出现的比率不同分化较好：64%分化中等：71%分化较差：83%85%的腺癌中DNA异倍体峰出现。---KashyapV.etal.JPatholMicrobiol.2000;43:265-269DNA-ICM的其他应用（三）治疗方案的选择*DNA异倍体病例对放疗更加敏感放疗后疗效评估*异倍体细胞减少，异倍体峰消失指导有癌前病变的怀孕妇女的随访和临床处理*1.DaveyDD,etal.CancerCytopathol,1998,84:11-162.BiesterfeldS.etal.CancerCytopathol,2001,93:160-164细胞DNA定量分析技术的临床应用宫颈癌及癌前病变的诊断；DNA和TBS检测或HPV检测联合的分流作用；为肿瘤的恶性程度评估提供参考；对宫颈疾病发展趋向的预测和疗效的评估；宫颈标本取材宫颈移行带（病变高发区）窥阴器充分暴露宫颈，将刷头中央较长刷丝从宫颈外口插入宫颈管内，两边较短刷丝抵住宫颈粘膜面，横放于3、9点位置，顺时针或逆时针旋转3-5圈，力度适宜。宫颈刷取材方法影响检测质量的因素通常为标本质量太差（上皮细胞过少，粘液、血细胞、炎