生物催化不对称合成手性药物中间体平台技术

2007-5-19苏州医药化工会议1生物催化不对称合成手性药物及中间体的平台技术2007(第二届)全国手性药物和中间体技术与市场发展研讨会苏州,2007.5.19SeminarReport2007-5-19苏州医药化工会议2背景“经典有机化学技术”手性生物催化技术chiralbiocatalysis—chiralsynthesiswithbiocatalysis2007-5-19苏州医药化工会议3背景“外消旋化合物”手性化合物chiralchemicals立体构型即为对映体结构chiralmolecules2007-5-19苏州医药化工会议4背景chiralbuildingblocks“手性中间体”手性砌块手性药物2007-5-19苏州医药化工会议5背景“不对称合成”手性合成chiralbiosynthesis生物催化手性合成—asymmetrysynthesiswithbiocatalysis2007-5-19苏州医药化工会议6不对称合成反应过程不对称合成前手性原料手性药物不对称生物催化化学催化不对称合成手性中间体2007-5-19苏州医药化工会议7不对称合成反应过程生物反应器产物底物产物手性化合物水or有机溶剂底物潜手性化合物EEEEEEEEEEE生物催化剂2007-5-19苏州医药化工会议8目的意义手性药物市场需求改变着化学药物构成，成为制药工业新宠儿手性化合物非手性化合物充分利用生物催化技术的优点、特点，更多更普遍地应用生物催化不对称合成技术制备手性药物，建立生物催化不对称合成手性药物或其中间体的技术平台，对手性药物或其中间体的平台技术进行深入的应用基础研究，揭示生物催化不对称合成反应的规律，合成一系列新的手性药物或重要中间体。2007-5-19苏州医药化工会议9问题★应用不够★缺少技术平台缺少高立体选择性的生物催化剂反应类型有限，底物结构有限反应的对映选择性不尽理想对生物催化反应过程缺乏了解生物催化不对称合成研究的问题2007-5-19苏州医药化工会议10技术平台建设生物催化合成手性化合物技术平台，研究与此相关的关键科学技术问题生物催化合成手性化合物技术平台生物催化剂筛选酶分子定向改造酶或细胞固定化非水相生物催化生物催化剂适应性反应与分离耦合立体选择性辅酶耦联再生生物催化反应器催化剂工程介质工程过程工程2007-5-19苏州医药化工会议11生产单一对映体手性化合物的方法生物催化与手性技术生物催化生物转化手性技术●手性源●消旋体拆分●不对称合成技术路线2007-5-19苏州医药化工会议12难点底物/产物抑制的解除辅酶依赖与辅酶再生立体专一性生物催化剂发现与改造难点2007-5-19苏州医药化工会议13生物催化不对称还原反应的主要问题2007-5-19苏州医药化工会议141生物催化的主要问题——酶的来源生物催化剂——酶AllpossibleenzymesAllenzymesinnatureAllknownenzymes2007-5-19苏州医药化工会议15在有机合成中应用的生物催化剂异构反应，取代反应，消除反应，加成反应异构酶，裂解酶水解反应水解酶氨基酸合成（C－N键）转氨酶糖苷键形成糖苷酶缩醛反应（C－C键）醛缩酶磷酸化作用（与ATP的生成相关）激酶氧化反应、环氧化反应过氧化酶氧化反应氧化酶（单、双加氧酶）醇、酮氧化还原反应脱氢酶氨水解、合成反应酰胺酶酯水解、合成反应脂化酶，酯化酶ReactionsEnzymes2007-5-19苏州医药化工会议16酶在生物催化中的应用2007-5-19苏州医药化工会议17最常用的生物催化剂——水解酶水解酶氧化还原酶其它酶其中在选择性生物催化中使用最多的酶是酯酶、脂肪酶和蛋白酶，近年来，环氧水解酶和腈水解酶也成为手性合成研究和应用的新热点。由于它的水解作用具有对映体的选择性，因此生物催化水解反应也广泛用于手性化合物的拆分。水解酶是最常用的生物催化剂，可催化水解酯、酰胺、蛋白质、核酸、多糖、腈和环氧化物等化合物，约占生物催化反应用酶的65%2007-5-19苏州医药化工会议18水解酶催化常用的商品酶制剂微生物脂肪酶：假丝酵母脂肪酶(CRL)、假单孢菌属脂肪酶(PSL)、南极假丝酵母脂肪酶(CAL)、动物脂肪酶：猪胰脂肪酶(PPL)、猪肝酯酶(PLE)、马肝酯酶(HLE)蛋白酶：枯草杆菌蛋白酶、-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、青霉素酰化酶2007-5-19苏州医药化工会议19不对称还原的商品酶制剂？P450脱氢酶羰基还原酶活性干酵母……2007-5-19苏州医药化工会议20酶源问题的解决办法——高酶活力和高立体选择性的产酶菌株筛选和改良●采用特征筛选平板、96孔板比色法，高通量筛选方法●应用易错PCR、DNA重组技术，提高酶的表达水平和催化性能筛选具有高酶活力和高立体选择性的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶菌株羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶（或醇脱氢酶）的定向进化，获得耐高产物浓度、耐溶剂的羰基还原酶与脱氢酶突变基因传统筛选量大繁杂，国外用高通量筛选装置！定向筛选比高通量筛选装置提高效率数百倍，成本大幅度降低！购买？2007-5-19苏州医药化工会议212氧化还原酶的主要问题——辅酶再生氧化还原酶需要辅酶作为反应过程中氢或电子的传递体2007-5-19苏州医药化工会议22氧化还原酶辅酶再生的解决办法羰基还原酶用糖作为能量供体保持辅酶再生循环共固定化？2007-5-19苏州医药化工会议23氧化还原酶辅酶再生的解决办法微生物整细胞转化通过微生物整细胞内的酶系进行转化，不需要对酶进行提纯，也不需额外添加昂贵的辅酶，因而减少工序并降低成本。在生物催化不对称还原反应制备手性药物或其中间体的研究开发中有不少相当好的实例。2007-5-19苏州医药化工会议24辅酶耦联再生生物催化不对称还原卤代酮酯制备手性卤代羟基酯辅酶的循环使用是氧化还原酶工业化大规模生产的瓶颈因素，多年来人们一直在致力于辅酶再生平台技术的研究与开发。OClCOOEtCOBEHOHClCOOEt(S)-CHBEHCOOHCO2大肠杆菌ADHFDHNADHNAD+ClOCOOEt大肠杆菌ClCOOEtOHＨＨHCOOHCO2Aureobasidiumpullulans2007-5-19苏州医药化工会议253生物有机合成的主要问题——底物抑制与溶解度问题水-溶剂双相体系解除底物抑制非水相生物催化ClOCOOEtClCOOEtHOH2007-5-19苏州医药化工会议26某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性酶介质条件热稳定性猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯水，pH7.0T1/226hT1/22min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2=1.5hT1/22min脂蛋白脂肪酶甲苯，90℃，400h活力剩余40％胰凝乳蛋白酶正辛烷，100℃水，pH8.0,55℃T1/2=80minT1/2=15min枯草杆菌蛋白酶正辛烷，110℃T1/2=80min核糖核酸酶壬烷，110℃，6h水，pH8.0,90℃活力剩余95％T1/210min酸性磷酸酶正十六烷，80℃水，70℃T1/2=8minT1/2=1min腺苷三磷酸酶(F1-ATPase)甲苯，70℃水，60℃T1/224hT1/210min限制性核酸内切酶（HindⅢ）正庚烷，55℃，30d活力不降低β-葡萄糖苷酶2-丙醇，50℃，30h活力剩余80％溶菌酶环己烷，110℃水T1/2=140minT1/2=10min2007-5-19苏州医药化工会议27有机相产物回收溶剂水-溶剂双相体系生物催化不对称还原反应羰基还原酶催化不对称还原反应水-溶剂双相体系解除底物抑制2007-5-19苏州医药化工会议28树脂原位吸附分离与反应耦联技术酶催化反应与产物分离耦合过程树脂原位吸附分离与反应耦联技术PPPPPPPPPPPPPPPSPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPEEEEEEESSSSPPSSSSS2007-5-19苏州医药化工会议294手性合成的主要问题——立体选择性提高对映异构体过量值（%e.e.）的办法？镜平面对映体A对映体BOHH3CHCO2HC*CH3HHOCO2HC*2007-5-19苏州医药化工会议30控制生物催化不对称还原反应立体选择性的方法催化剂最重要的性质不是它的活性，而是其选择性，然后是稳定性生物催化剂的最大优势在于它们无以比拟的选择性，尤其是其对映异构体选择性筛选高立体选择性的生物催化剂对产酶微生物细胞进行预处理控制微生物细胞的生理状态固定化微生物细胞筛选适宜的底物添加共底物或抑制剂选择合适的反应体系2007-5-19苏州医药化工会议31010203040506070801234567891011121314151617菌种编号e.e.%10102030405060708090123456789101112131415161718菌种编号e.e.%181920212223242526272829303132333435控制生物催化不对称还原反应立体选择性的方法不同种类的生物催化剂（酶或其细胞）作用于同一种底物可产生不同对映体的产物可用于还原羰基化合物的微生物种类很多，包括各种细菌，放线菌，酵母，霉菌应该根据不同产物要求筛选不同的产酶菌株筛选高立体选择性的生物催化剂(欧志敏,等,2003)2007-5-19苏州医药化工会议32控制生物催化不对称还原反应立体选择性的方法筛选得到的产酶菌株往往对映异构选择性不能满足要求有时可以用加热、调pH、添加表面活性剂等方法进行预处理改善其对映异构选择性对产酶微生物细胞进行预处理微生物的生理状态不同在催化不对称还原时的产物手性醇构型有可能不一样调节细胞的生理状态有可能获得理想构型的产物AllanC.Dahl等人曾报道：厌氧发酵状态的酵母在高底物浓度时可将3-氧-酯还原为D-型3-羟-酯，有氧状态下生长的酵母在低底物浓度时可将3-氧-酯还原为L-型3-羟-酯控制微生物细胞的生理状态2007-5-19苏州医药化工会议33控制生物催化不对称还原反应立体选择性的方法一般认为生物催化的氧化还原反应很难采用固定化酶或固定化细胞方法，因为在连续或反复分批操作时反应过程需要的辅酶很难再生与循环使用但也不乏成功实例，如RenatoWendhausenJr.等人采用固定化在温石棉纤维中的面包酵母在填充床反应器中进行反应，实现了大规模连续生产手性醇。反应稀释速率0.17h-1，产物收率29mgl-1h-1，光学纯度为90%ee，持续运转30d。固定化微生物细胞固定化微生物也会影响不对称还原反应的立体选择性如:KaoruNakamura等人报道游离面包酵母还原β-酮酯生成D-羟酯，而固定在藻酸镁中的面包酵母还原β-酮酯则生成L-羟酯潘冰峰等人采用二甲基硅橡胶包埋白地霉菌体与游离菌体转化β-羰基苯丙酸乙酯生成(R)-β-羟基苯丙酸乙酯对比时，固定化后产物的对映体过剩值从49%提高到81%ee。2007-5-19苏州医药化工会议34控制生物催化不对称还原反应立体选择性的方法底物分子结构中前手性碳原子周围的基团不同，对产物的手性构型有很大影响产物手性的构型主要取决于羰基酯基团中烷基链的长短，当烷基链很短(2个C)时，产生S-型醇，当烷基链长一些(5个C)时产生R-型醇Zhi-LiangWei等人在还原苯乙酮衍生物时，分别还原了2-氟-苯乙酮、2-氯-苯乙酮、2-溴-苯乙酮、2-碘-苯乙酮四种底物，在相同还原条件下产生手性醇的对映体过剩值：2-氯-苯乙酮2-溴-苯乙酮2-氟-苯乙酮2-碘-苯乙酮由此可见，苯乙酮的2位取代基不同时，产物手性醇的光学纯度有很大差异。在合成药物中间体时选择合适的底物可获得理想构型的手性醇。筛选适宜的底物2007-5-19苏州医药化工会议35控制生物催化不对称还原反应立体选择性的方法在反应体系中添加不同的共底物，有时会对产物的构型引起变化如AllanC.等人报道用面包酵母还原羰基酯时，以蔗糖为共底物产物为R-型醇，以葡萄糖为共底物产物为S-型醇可选用的