第一章细胞培养技术的基本理论知识

第一章细胞培养的基本理论知识细胞培养技术第一节细胞培养基本概念一、细胞培养技术细胞培养技术是指从人或活体动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，该技术也可笼统称之为体外培养技术（invitroculture）。细胞培养（cellculture）体外培养组织培养（tissueculture）器官培养（organculture）细胞培养(CellCulture)培养物是单个细胞和细胞群。组织培养(TissueCulture)指的是从体内取出组织，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。器官培养（OrganCulture）培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。三种培养方式的来源广泛，既可以是胚胎和成体的组织和器官，亦可是活检或手术取下组织或器官。组织或器官去除筋膜，脂肪组织后进行粗切器官培养组织培养（1mm3）细胞培养（单细胞）细切酶消化二、细胞培养的优点与缺点优点：1.能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动等。2.选择对象均一，重复；物理、化学、生物等因素可控；可采用各种研究技术、记录方法。3.可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。4.可作为制备生物制品、单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段。缺点：人工所模拟的条件与体内实际相比仍有很大差异，当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中久了，必然发生变化。体外培养相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响，导致原有组织结构和细胞形态变化，分化减弱或不显，细胞趋向单一化。注意：体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体，体外实验结果不能与体内实验结果完全等同！！第二节培养细胞生物学一、体内外细胞分化的差异1.细胞增殖和分化：增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体.接触抑制和密度抑制2.体内外细胞的差异：细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态；分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。。二、培养细胞的分化不适应（Deadaption）细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性。脱分化（去分化）（Dedifferentiation）由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力丧失，并很难再现。三、体外培养细胞的形态1.贴壁型2.悬浮型上皮型细胞成纤维细胞型游走细胞型多形型细胞绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞1234贴壁型细胞：必须贴附于底物才能生长的细胞称为贴壁型细胞贴壁是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式，细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴壁型细胞。目前已有很多种细胞能在体外培养生长，包括正常细胞和肿瘤细胞。例如：成纤维细胞、骨骼组织(骨及软骨)、心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺、皮胺、神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞及各种肿瘤细胞等。上皮样细胞型名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于来源：来源于外胚层，内胚层细胞（个别例外）如：皮肤及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡，上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则，多角形中有圆形核生长特点易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺路石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动成纤维细胞型名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养的平滑肌细胞（免疫组织化学染色显示肌动蛋白）游走型细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。多形型细胞多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样规则。体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞。注意：细胞形态并非固定不变，可随培养条件、生长时期、细胞数量等而变化，细胞形态只是对培养物判断或识别的参考指标。血清Hela高血清低血清成纤维细胞样上皮样细胞pHHela太酸或太碱标准pH成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度3T3低密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞悬浮型细胞：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：来自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞也可能特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获缺点：观察不方便，纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离四、细胞的生长和增殖过程培养细胞一代生存期仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。细胞传一代有可能倍增3-6代。传代是将细胞从一个培养瓶皿转移到另一培养瓶皿内生长的过程。1.原代培养（PrimaryCulture）阶段或称初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次传代，随不同的组织时间长短不一，一般为1-4w。细胞结构和形态与体内最接近、细胞群异质，细胞分裂但不旺盛，克隆形成率差。2.传代培养（Subculture）阶段或称继代培养。也就是细胞系（Cellline）阶段，细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代。应在初代培养后期或传代早期对细胞进行冻存。传代的频率或间隔与培养基的性质。接种数量的多少和细胞的增值速度相关。游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）每代贴壁细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等潜伏期：细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停滞期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度限制原代培养传代培养选取生长良好的细胞加入胰蛋白酶消化液镜下观察倒去酶液，加入培养液反复吹打制成细胞悬液按比例分装后培养3.衰退期此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。第三节培养细胞的生存环境与条件１．细胞的营养需要：１）基本营养物质：氨基酸（１２种＋谷氨酰胺）维生素葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子等２）促细胞生长因子：多由血清提供２．细胞的生存环境１）温度条件对细胞生长的影响不同生物来源的组织细胞培养温度不同；体外培养动物细胞最常用的温度是37℃。耐低温不耐高温！培养细胞对低温的耐受力较对高温强；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡;相反，温度不低于0℃时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用。在生理温度范围内，温度与细胞生长率之间存在正相关关系。２）气相环境对细胞生长的影响动物细胞培养的气相环境都是采用5%CO2与95%空气（提供氧）的混合气体。Ｏ2参与细胞的能量代谢过程。ＣＯ2用于维持培养液的酸碱度。一般多为开放式培养3）渗透压正常渗透压维持细胞张力并调节细胞代谢，一般细胞渗透压为260～320mmol/L。4）培养液的酸碱度对细胞生长的影响大多数的有机体细胞能在pH6.0～8.0的环境中生存。最适宜的pH值范围是7.2～7.4。体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力5）无污染、无毒（前提条件！）3．细胞常用的培养液和试剂培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。平衡盐溶液主要包括培养基其他培养用液天然培养基合成培养基1）平衡盐溶液(BalancedSaltSo1ution：BSS)BSS又称生理盐水或盐溶液，主要由无机盐和葡萄糖组成。本身具有维持渗透压，调控酸、碱度平衡的作用，同时能供给细胞生存所需的能量和无机离子成分；用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。BSS内含少量的酚红，作为溶液酸碱度变化的指示剂；溶液变酸时呈黄色，变碱时呈紫红色，中性时呈桃红色，借此易于观察到培养液pH的变化。几种常用的平衡盐溶液：Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hank’s、D-Hank’s、Dulbecco（都有相应配方）最简单的BSS是Ringer。D-Hank’s与Hank’s的一个主要区别在于前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。配制平衡盐溶液也应当用新鲜的三蒸水。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温高压灭菌。有浑浊或沉淀时，应重新配制PBS（Phosphate-BufferedSallines）KCl0.20gKH2PO40.20gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gDPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines）标准型CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)0.10gKCl0.20gKH2PO40.20gMgCl2·6H2O0.10gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gD-Hanks’平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g2）培养基培养基就是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基的基本要求:体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。培养基可分为天然培养基、合成培养基。合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。目前常用的MEMEagle培养液，仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和八种维生素，成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系的培养。在它们的基础上，后又改良成BME(BasalMediumEagle：BME)和DMEM(DulbeccoMEM)二种培养液，应用也十分广泛。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。合成培养基优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。市场上可提供干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程比较繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便，但比较昂贵。如何选择培养基？(1)建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。(2)本实验室惯用的培养基(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据试验结果选择最佳培养基培养基的配制（针对干粉培养基）1.认真阅读说明书。2.配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要在培养基完全溶解之后才能添加。3.配制所用的水应为三蒸水，离子浓度很低，水电阻达30万Ω以上。4.所用器皿应十