CCK-8操作说明与检测步骤

DOJINDO操作说明细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100ml/孔)。将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5%CO2的条件下)。2.向每孔加入10ml的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。4.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。5.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。细胞增殖-毒性检测1.在96孔板中配制100ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5%CO2的条件下)。2.向培养板加入10ml不同浓度的待测物质。3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6,12,24或48小时)。4.向每孔加入10mlCCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。5.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。7.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。制作标准曲线1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。2.按比例(例如：1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。3.接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，O.D值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间)。DOJINDO检测步骤CCK-8检测步骤1.向各孔中加入100μl细胞悬液。a)2.在37℃下预孵育培养板。b)3.向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10μl。4.37℃下孵育。5.向各孔中加入10μl的CCK-8溶液d)。6.37℃下孵育1-4小时。e)7.测定450nm处的OD值。a)使用适当的培养基制备50,000-100,000个/ml的细胞悬液。b)建议使用CO2培养箱过夜预培养。c)使用培养基或PBS来制备溶液。d)如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有CCK-8的待测溶液在450nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入CCK-8，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100μl培养基和10μlCCK-8进行检测。e)白细胞可能需要培养较长时间。活力计算细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）]×100A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力问答：1.一个孔中应接种多少个细胞？当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。2.能否用384孔板进行试验？可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。3.能否用24孔板进行试验？可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。4.酚红会影响检测吗？不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。5.CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。6.CCK-8能否检测细菌细胞？可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μlE.coli培养液中加入10μlCCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。7.CCK-8稳定吗？CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。8.如果没有450nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？还可使用450nm到490nm之间的滤光片。9.如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。10.CCK-8是什么颜色？应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。11.CCK8能否对活细胞进行染色？不能。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST8)，并通过电子载体1MethoxyPMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能对细胞进行染色。12.CCK8检测溶液对细胞是否有毒？CCK8溶液自身因为高浓度的1MethoxyPMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。13.在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK8之前更换培养基，去掉药物的影响。14.每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？可能会有以下几个原因：1.当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000100,000个/孔范围内摸索条件。15.如何设定空白对照？在不含细胞的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度作为空白对照。16.哪些物质会影响CCK8的测定？当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定，例如含有维生素C的Glucose等(一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。17.在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如：可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。18.设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。19.说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板货12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？…一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。20.在CCK-8显色过程中，如何终止反应？有一下几种方法（96孔板）：1、在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。2、每孔加10μl0.1MHCL溶液。3、每孔加10μl1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。21.必须预培养细胞吗？不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。22.如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10Mm的话，将会100%抑制。23.CCK-8试剂的保存条件？在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。24.预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。25.CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。26.悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。27.应该每次做标准曲线吗？建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。28.有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？…不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。29.实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？建议使用一个孔作一下检测，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。