急性毒性试验

急性毒性试验急性毒性试验(单次给药毒性试验)主要观察对实验动物一次给药后所产生的毒性症状及其程度，出现和消失的时间，死亡的发生率并计算出其最大给药量，最小致死量、半数致死量(LD50)等。由于中药毒性常较小，单次给药往往不能表现明显的毒性作用，我国药政部门把一日内多次给药观察受试药物毒性的实验也称作急性毒性实验。急性毒性试验的目的是推测新药对人的急性毒性的强弱。同时，它可以为长期毒性试验、生殖毒性试验、致突变试验等试验设计提供剂量选择依据和有关毒性信息，还可以推测受试药物毒性发生的速度和持续时间，与半数有效量(ED50)比较判断新药的安全系数。因此，急性毒性试验对了解新药的毒性是非常必要的。鉴于种种因素造成急性毒性试验结果(症状和致死量)在不同实验室内有较大的差异，且耗费大量动物而所取得的动物毒性的信息量相对较少，因此，各国目前都在修订急性毒性试验的技术要求，希望能利用尽可能少的动物数量而取得有价值的信息，同样达到急性毒性试验的目的。第一节急性毒性试验方法的有关问题一、动物(一)动物种动物种(或系)的差异是动物急性毒性差异的主要原因，药酶则是毒性种差的重要原因之一。为推测新药对人的急性毒性，某些发达国家动物急性毒性试验要求包含非啮齿类动物(除家兔外)在内的两种动物，我国对此未作出明确规定。由于中药已在临床长期使用，一般认为，如尤特殊情况，使用一种动物已基本上达到急性毒性试验的目的。目前虽常用的实验动物是小鼠或大鼠。但在某些特殊情况下，例如受试物中已知含有强烈胃肠刺激物，就还应再采用非啮齿类大动物进行实验，否则，即使毒性较大(如巴豆)也并不能引起大、小鼠呕吐反应。(二)动物的年龄、性别、体重急性毒性受动物的健康状态、年龄、性别、遗传因素、体重、药物的吸收、分布、代谢、排泄和内分泌激素等的影响。未成年的动物药酶活性一般较低，对于经代谢后减毒的药物表现毒性较强。而且，年幼动物药物代谢功能和敏感度较易发生变化，性别间的特性也尚未确立，因此，口服毒性通常使用年轻的性成熟的动物，—般小鼠6—8周龄，两种性别，体重18-22g(同次试验体重相差不超过2g)，大鼠6—8周龄，两种性别，体重120～150g(同次试验体重相差不超过10g)。(三)动物数量视不同试验而异。最小致死量或半数致死量，小动物(大鼠、小鼠)试验组在三组以上，每组—般至少10只动物(雌雄各半)。一些国家对动物数和组数不作规定，因此，有只用3只一组经多组试验测得近似致死量或LD50者。大动物(犬、猴)并不—定要求得到LD50，可用少量动物采用剂量递增的方法观察中毒症状，求近似致死量即可。最大给约量试验—般要求用小鼠或大鼠20只即可。二、试验准备实验应在符合GLP的实验室内进行，实验样品质量和稳定性应符合要求，与药效学及临床试验一致。(一)样品液的配制中药材町用浓缩煎剂或浸膏，中药制剂可用不含辅料的提取物加水或用o．5％羧基纤维素钠，0．5％吐温—80，5％阿拉伯胶等混悬剂、增溶剂配成混悬液等，尽可能配成水溶液，水不溶性成分可用植物汕配成油溶、乳浊液。也有用乙醇、聚乙醇等溶剂配成样品液者，但溶剂本身的急性毒性能干扰试验结果，因此，急性毒性试验报告中应对样品液的配制方法加以详细说明，必要时设溶剂对照组。(二)样品液的浓度及给药容量为了求得最低致死且或半数致死量，需要设不同剂量组，使部分组反应率在50％以上，部分组反应率在50％以下。不同剂量的设定有两种方式，—是浓度一定不同给药容量，另—种是容量一定不同给药浓度，两者各有所长。浓度一定适用于某些已经固定浓度的制剂，其有利之处是避免了渗透、粘度、溶质颗粒的分散状态等理化性状不—致对毒性试验结果的影响，因此，浓度一定也可得到较好的结果，但由于动物的投药用量是有限的，范围较窄，按体重给药容量难以达到试验要求。因此，通常采用同容量不同浓度的给药方法，注射给药药液浓度应勺体液浓度等渗(至少不应低渗)，口服液不必作特殊考虑，对毒性低的中药制剂而言，应以能保持一定流动性的最大浓度作为口服样品液。三、给药方法(一)动物禁食动物购入后应在实验室观察1星期，口服给药前，为减少吸收差异和大容量给药造成胃急性扩张，小鼠和大鼠至少应停食4-6h，要求一夜停食(不停水)，投药后再停食3-4h。(二)给药途径中药新药除临床给药途径外，—、二类新药还希望其他给药途径，水溶性药物应同时采用静脉给药途径，其他如油剂，混悬剂之类可采用皮下给药途径。腹腔汁射在人体极少用，中药粗制剂成分复杂，动物毒性试验中也尽可能少用，以避免腹腔刺激性的干扰。各给药途径的容量一般为小鼠0．4—0．5ml／20g(体重)，大鼠lml／l00g(体重)。小鼠口服最大容量不超过0．8ml／20g(体重)，其他途径不超过0．5ml／20g(体重)。大鼠口服最大容量不超过2ml／l00g(体重)，其他途径不超过lml／l00g(体重)。四、急毒试验观察指标和致死量的计算(一)观察指标不能把求得致死剂量看作是急性毒性实验的唯一要求。发现毒性症状及毒性反应的靶器官同样是急毒实验非常重要的目的。给药前后应观察体重、进食、进水的状况，密切观察异常毒性症状，特别是给药后的一、二日。以后1日至少观察1次，观察7日观察症状包括①行动：不安定、多动、发声；②神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态异常；③自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流汨、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼吸；④死亡。应每日记录体重、毒性反应和死亡情况，濒死动物应单独饲养，死后及时解削进行肉眼观察和病理组织学观察。试验结束存活动物也进行解剖，如有病变进行组织学观察。(二}致死剂量计算可用Bliss点斜法、简化机率法、改进寇氏序贯法等计算最小致死量或半数致死量。Bliss法严谨精确，缺点是计算非常繁复。但近代有计算机软件，汁算方法可推荐Bliss法。各种方法原则基本相同，如：①剂量刘数值应为等差，即剂量应按等比级数排列；②各组动物数应相等；③死亡率应在50％上下基本对称分布等。但各种方法还各有特殊设计要求，如有的要求Dm和Dn必须为100％和0％死亡率等，可参考有关专著，此处不赘述。如受试物毒性低，测不出LD50，可求得最大给药量。第二节急性毒性试验方法一、LD50的测定最小致死量是使动物刚好致死的药物剂量，但由于药物的性质，给药方法和个体差异，每只动物的最小致死量确很大的差异，实验和统训学原理表明一群动物最小致死量的平均值相当于半数致死量。半数致死量测定方法很多，但实验没计大同小异，所不同者为算方法的不同，其试验方法如下：预试验：目的是找出0％及100％估计致死量。更确田地说是找到—个0死亡的最大剂量和100％死亡的最小剂量的估值以决定实验中采用的最大剂量(Dm)和最小剂量(Dn)，，这在测定中非常重要，是实验成败的关键。可用雌或雄性动物，设四组以上，每组3-4只，先用1；10的剂量比给药(如5mg／kg、50mg／kg、500mg／kg、5000mg／kg固定剂量)。观察7日，记录死亡动物数。然后在死亡数4／4和0／4两组之间按1；2(如50mg/kg、100mg/kg、200mg／kg、400mg／kg)以下的剂量比进行重复试验，以此测得近似的0和100％死亡率。正式试验：在预试验Dn和Dm剂量范围内按等比设三个以上剂量组，其组间剂量的比值，一般在1；0．6至1：0．9范围内。购入动物试验前应驯化1星期，随机或按体重分组，每组10只以上，雌雄各半，分别编号，给药前应禁食(不禁水)过夜。各给药组和溶剂对照组按体重给药后，试验当日应多次观察，第二日至最后—日应每日有二人以上同时观察1次并及时详细汜录毒性反应症状，症状出现和消失的时间，死亡时间，第七日全部动物测量体重处死并剖检，肉眼观察病变情况。有毒性反应、体重减轻或脏器有病变的动物应在剖检后立即进行主要脏器的病理组织学观察。LD50和最小致死量及其可信限的汁算可采用Bliss法，改进寇氏法、点斜法、简化概率单位法或其他的计算方法。汁算结果对比表明，不同的汁算方法，结果间一般无明显差异，而不同实验室对同一样品试验结果却常见有显著差异。冈此，采用较简单的计算方法完全可以满足LD50计算的准确性。二、最大给药量试验如同受试药物的浓度或体积限制，无法测出半数致死量(LD50)时，作最大给药量试验。试验选用拟推荐临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度(溶液仍有较好的流动性)，最大体积的给药量1次或1日内2～3次给予动物。以小鼠口服为例：动物数不得少于20只，雌雄各半，容量—次不超过0．4ml/10g(体重)，多次给药间隔时间不低于4h，观察7日，汜录毒性反应和体重变化。如仍未见毒性反应或体重正常增加，则可认为该药物小鼠最大给药量未见毒性反应，或LD50大于最大给药量。经统计学计算，该剂量不可能大于LD14。如用10只动物未见毒性反应或死亡则该剂量不可能大于LD26。三、近似致死量试验国外近年来有采用少量动物进行近似致死量测定的方法。其中有的类似LD50的预试验或霍恩氏法。每组用3—4只动物，设多组，详细观察并汜录动物毒性反应井进行血液学，血液生化以及病理组织学观察。有的采用剂量递增法即—只动物一个剂量以几何级数递增，根据前个剂量的反应，决定下—个剂量。或采用剂量累积法，同一批动物间隔一定时间、剂量由小到大给药，观察毒性反应，同时结合血药浓度的测定，确定动物的急性毒性反应、靶器官、中毒或致死剂量、毒性反应时的血药浓度。剂量递增法类似于LD50测定的阶梯法(或称序贯法、上下法)，适用小动物而且毒性反应出现快的试验，10—20只动物即可测定。剂量累积法则适用大动物，利用大约6只合格动物即可进行急性毒性试验的全面观察。另外，国外还有采用固定剂量给药观察近似致死剂量，以决定药物毒性大小者。四、急毒试验结果评价(一)可靠性评价为保证急毒结果，实验条件应符合GLP的要求，供试品质量稳定，动物合格，实验方案，实验原始记录，标准操作规程，总结报告应符合要求。总结报告中应包括摘要、供试品、试验动物，试验环境、给药方法、观察方法、毒性反应症状、体重变化、病理组织学变化、雄性反应和死亡出现的时间、LD50和LD5及其可信限的计算方法、结果讨论等。根据试验结果对急性毒性进行全面评价。(二)安全性评价(1)根据急性毒性试验结果判断供试药物毒性的强弱、类型。国内尚无统—规定。(2)急性毒性试验结果对临床研究有指导意义，可以为临床研究时探索安全有效剂量避免出现急性不良反应提供依据。但是，鉴于人体与各种动物对各类化合物的吸收、分布、代谢、排泄以及各类型毒性反应的差异，尚无规律可循，现有化学药品统计数据表明，在进行临床研究时，仍应根据实验结果参考文献资料报道进行由低到高的安全治疗剂量的探索。(3)急性毒性试验结果对推测长期毒性试验剂量具重要意义，、不同种动物之间的差异，急性毒性结果无论用体重剂量还是体表面积剂量计算常见有差异而尚无规律。如果急性毒性试验与长期毒性试验采用同种动物，则急性毒性试验的剂量对长毒有更大的参考价伉。即使如此，还应考虑该药的蓄积作用。不同种动物间虽然也可以进行剂量推测但仅可作为参考．仍需要长期毒性试验前进行必要的预试验。三、动物规格和数量长期毒性实验一般由雌雄各半、健康无病、检疫合格的动物组成。各组平均体重相似，体重变异不超过20％。对照组动物数，可以与给药组相同，也可按公式计算：对照组动物数：给药组动物数x剂量组数的平方根。试验周期3个月之内的，啮齿类宜用6—8周龄的大鼠，每组数量不少于20只；非啮齿类可用6—10月龄的犬，每组数量6只；试验周期3个月以上的，啮齿类宜用5、6周龄的大鼠，每组数量应增至30-40只。非啮齿类可用4-6月龄的犬，每组数量6只。确定每组动物数的原则，主要考虑药物毒性致实验动物死亡数，实验中处死动物的批次和实验结束时及停药后观察恢复状况所需能用于统计分析的动物数。四、饲养条件(1)通风良好：动物饲养室的换气次数和气流速度能控制在10～15次／h和13—18cm／s较好，目的是利于动物的散热及排除臭气、粉尘和微生物，又不明显影响室内的温、湿度和动物的耗能。(2)光照