测定药物小分子与脱氧核糖核酸相互作用方法的研究

·综述·基金项目：江苏省自然科学基金项目（ＢＫ２００３０８０）作者简介：何华，男，副教授Ｔｅｌ：[phone]Ｆａｘ：[phone]Ｅｍａｉｌ：ｄｏｃｈｅｈｕａ＠１６３ｃｏｍ测定药物小分子与脱氧核糖核酸相互作用方法的研究进展何华１，王羚郦１，戴丽１，焦庆才２（１中国药科大学分析化学教研室，江苏南京２１０００９；２南京大学生命科学学院药物生物技术国家重点实验室，江苏南京２１００９３）摘要：目的介绍测定药物小分子与脱氧核糖核酸相互作用方法的近年进展，为抗肿瘤药物的体外筛选以及新药设计提供参考。方法对９种分析技术在研究药物小分子与ＤＮＡ相互作用机制的方面的基本原理、研究热点及其应用作了评述。结果小分子与ＤＮＡ相互作用的模式较为复杂，归纳起来大致可分为非共价结合、共价结合和剪切作用３类。其中，非共价作用有３种方式：静电作用、嵌入作用和沟槽作用。结论对于ＤＮＡ靶向分子／ＤＮＡ复杂体系的研究，必须综合运用各种方法和手段进行全方位的研究才能得到比较可靠的结论。关键词：药物小分子；相互作用；脱氧核糖核酸；分析技术中图分类号：ＴＱ４６０７２文献标识码：Ａ文章编号：１００１－２４９４（２００５）０７－０４８１－０５脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）是人体内一类重要的遗传物质、遗传载体。研究药物小分子与ＤＮＡ之间的相互作用，对阐述抗癌、抗病毒药物的作用机制，实现抗癌药物的体外筛选，建立有效选择特定抗癌药物的简便方法具有潜在的应用价值。小分子与ＤＮＡ的相互作用模式归纳起来大致可分为非共价结合、共价结合和剪切作用３类。通常认为，小分子与ＤＮＡ的非共价作用有３种方式：①外源分子或离子插入ＤＮＡ分子双螺旋碱基之间的嵌入作用；②外源分子或离子与ＤＮＡ分子的带负电荷的核糖磷酸基骨架之间的静电作用；③通过非特异性的静电作用结合到荷负电的ＤＮＡ双螺旋外部的沟槽作用［１］。金属配合物，尤其是过渡金属配合物是一类重要的ＤＮＡ靶向化合物。研究表明，这类化合物可望设计成人工核酸酶，实现对ＤＮＡ链上某些位点的特异性剪切；也有望设计并合成出某些性能优良的抗肿瘤或抗病毒药物［２］；其中有些还可作为结构和构象的探针，对Ｂ型和Ｚ型ＤＮＡ进行手性识别。以菲咯啉、联吡啶、卟啉、碱类配体和Ｓｈｉｆｆ碱等为代表的配体所形成的配合物与ＤＮＡ的作用更是引人注目［３］。人们采用多种现代实验手段，从不同角度对它们之间的作用进行了广泛的研究，得到了许多有益的结论。笔者对ＮＭＲ，ＣＤ，ＵＶ，共振光散射光谱，共振拉曼光谱，荧光探针，电化学，黏度及微量热等分析技术在研究药物小分子与ＤＮＡ相互作用机制的方面的应用以及最新研究进展作详细评述。１药物小分子与ＤＮＡ相互作用的测定方法１１ＵＶＶｉｓ光谱吸收光谱是研究配合物与ＤＮＡ相互作用的一种直接的方法。过渡金属配合物与ＤＮＡ结合后，其配体所处的环境发生改变，使吸收光谱波长和强度发生一系列的变化。吸收光谱在加入ＤＮＡ后，若配合物的吸收强度减小，波长红移，可认为是配合物插入ＤＮＡ的证据之一［４］。因为插入配体与ＤＮＡ碱基对可发生π电子堆积，插入配体的π空轨道与碱基的π电子轨道发生偶合，使能级下降，导致π→π跃迁能量减少，从而产生红移现象；红移的程度反映出配合物插入能力的大小。同时，偶合后的π轨道因部分填充电子，使π→π跃迁几率减少，产生减色效应，减色效应的强弱，也能反映出插入能力的大小，插入能力越强，减色效应越大。通过电子光谱减色效应利用下式可计算出键合常数：［ＤＮＡ］／（εａ－εｂ）＝［ＤＮＡ］／（εｂ－εｆ）＋１／Ｋｂ（εｂ－εｆ）［５］式中［ＤＮＡ］代表ＤＮＡ的浓度，εａ为配合物的表观摩尔消光系数，εｂ，εｆ分别为键合和自由的配合物的摩尔消光系数，Ｋ为配合物与ＤＮＡ的键合常数。Ｋ由拟合直线与ｙ轴相交的截距求得。程圭芳等［６］用紫外可见光谱法和紫外可见光谱电化学法研究了柔红霉素（ＤＮＲ）与不同寡聚核苷酸之间的相互作用。结果表明，ＤＮＲ优先作用于寡聚核苷酸的ＣｐＧ位点，然后是ＡｐＧ和ＡｐＣ位点。Ｅｌｖｉｓ等［７］和Ｃｒｉａｄｏ等［８］用紫外光谱研究了Ａｇ（Ⅰ），Ａｕ（Ⅲ），Ｐｔ（Ⅳ）３种贵金属的不同衍生物合成，与ＤＮＡ的相互作用机制，以及体内的抗肿瘤活性。紫外光谱在新合成药物筛选上起到重要作用，已研究了最新抗墨西哥利什曼原虫的［Ｃｕ（ｄｐｐｚ）］２ＢＦ４与ＤＮＡ的结合机制［９］，并借以研究了以甲基绿为分子探针，脂质体诱导的ＤＮＡ构象变化［１０］。１２稳态荧光和时间分辨荧光光谱利用荧光光谱研究配合物特别是Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｇｙ３＋，·１８４·中国药学杂志２００５年４月第４０卷第７期ＣｈｉｎＰｈａｒｍＪ，２００５Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ４０Ｎｏ７Ｓｍ３＋为代表的过渡金属离子配合物与ＤＮＡ的相互作用是近年来最为活跃的领域。配合物与ＤＮＡ插入结合时，通常引起荧光强度增强，并且增强的幅度与配合物和ＤＮＡ的结合程度有关。［Ｆｅ（ＣＮ）６］４－被认为能够用于检测配合物与ＤＮＡ的作用强度［１１］。因为游离或水合状态的正电荷配离子很容易被高负电荷阴离子［Ｆｅ（ＣＮ）６］４－猝灭，但由于ＤＮＡ磷酸骨架带有负电荷而成为多聚阴离子，对［Ｆｅ（ＣＮ）６］４－有强烈的排斥作用，配合物插入ＤＮＡ越深，受保护程度越大。同时配合物的激发态寿命也大大增强，适当延缓检测时间，可非常显著地降低来自散射光、样品和试剂的本底荧光强度（１～１０ｎｓ）干扰，即为时间分辨荧光光谱。配合剂一般都有芳香族生色团，并含有多个能和金属离子键合的基团，如氮原子或羧基，和金属离子形成配合物。比传统的有机荧光基团有很多优势，详见表１。表１有机螯合物和镧系螯合物荧光比较荧光种类优点缺点典型有机标记物（如荧光黄）化学稳定，高强度荧光，传统荧光检测器适用Ｓｔｏｋｅｓ位移小，荧光寿命短，结果受背景信号干扰，荧光强度对环境、温度敏感镧系离子配合物Ｓｔｏｋｅｓ位移大，发射峰窄，荧光寿命长，可选择性区分背景信号，荧光强度对环境、温度不敏感金属复合物稳定性较低，配合物形成过程复杂，与最好的有机荧光探针相比荧光强度弱，特殊的时间分辨仪器用于选择性测定多年来，人们利用荧光作为检测技术，不断改变配合物结构和仪器结构，提高对ＤＮＡ的检测灵敏度。Ｖｉｖｉａｎ等［１２］综述了以镧系离子作为探针的ＤＮＡ检测技术的发展；毛细管阵列扫描［１３］已用于荧光标记的ＤＮＡ片断的时间分辨检测。并有研究表明，将银离子涂布于惰性膜上可使ＤＮＡ的固有荧光增强数倍［１４］。同时发展了不同的荧光配合物探针，以铕离子标记的聚乙烯胺抗生蛋白可以作为同源时间分辨荧光的普适检测试剂［１５］，以ＤＮＡ介导的ＥＤＴＡＥｕ（ＩＩＩ）β二酮可用于以荧光检测的ＤＮＡ杂交分析［１６］。能量共振转移与时间分辨荧光结合作为监控分子间相互反应的技术发展迅速［１７］，ＤＮＡ损伤的临床检测［１８～１９］更加灵敏，简便；时间分辨荧光分析技术与聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术相结合，可用于检测特异的靶ＤＮＡ序列，该技术简称为ＰＣＲＴＲＦ。Ｒｉｎｔａｍａｋｉ等［２０］以铕离子为标记探针，利用该技术对肺炎链球菌的ＤＮＡ进行检测，大大增加了检测灵敏度和自动化，便于在临床上推广应用。１３圆二色光谱（ＣＤ）ＣＤ可以检测有无旋光物质的存在，测定透析后配合物的ＣＤ光谱，还可帮助确定配合物与ＤＮＡ的相互作用有无异构选择性。外消旋配合物溶液由于有等量的旋光异构体，不显示圆二色信号。将配合物与ＤＮＡ作用后再透析，透析液如果出现明显的圆二色信号，说明透析液中两异构体不再等量，其中一种居多。据此可判断配合物与ＤＮＡ间是否存在手性选择结合。ＣＤ谱在结合模式识别上具有极大的优势。利用ＣＤ，人们对Ｍｎ２＋与ＤＮＡ的反应过程进行研究，结果表明Ｍｎ２＋对ＤＮＡ构象有较大影响［２１］。以ＨＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）和ＤＯＤＡＢ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）形成的阳离子双分子层对ｄＡＭＰ（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）构像的影响，说明与阳离子络合的ＤＮＡ变性很可能是它构像改变的根源［２２］。将ＣＤ谱用于研究组蛋白Ｈ１ＤＮＡ复合物分裂机制［２３］以及转染活性肽ＤＮＡ复合物结构和相互作用机制［２４］。由于ＣＤ谱在手性鉴别上的优势，已证明ＤＮＡ诱导的ＴＰＰＳ（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）和ＴＭＰｙＰ［ｔｅｔｒａｋｉｓ（１ｍｅｔｈｙｌ４ｐｙｒｉｄｉｎｉｏ）ｐｒｏｐｈｙｒｉｎａｔｏ］二聚体的手性随两者比例的变化而变化［２５］。计量年等对各种钌衍生物与小牛胸腺ＤＮＡ作用包括ＣＤ色谱在内的光谱进行研究，合成出了大批具有不同作用机制的钌衍生物，对筛选抗肿瘤活性钌配合物作出了较大贡献［２６］。１４黏度在缺少晶体结构资料的情况下，黏度测定是检测配合物与ＤＮＡ是否以插入方式结合的最有效的方法，其结果比光谱数据更具说服力。小分子与配体形成的配合物通过经典插入方式与ＤＮＡ作用时，ＤＮＡ相邻碱基对的距离会变大以容纳插入配体，导致ＤＮＡ双螺旋伸长，ＤＮＡ溶液的黏度增加；当以静电沟面结合等非插入方式与ＤＮＡ作用时，ＤＮＡ溶液的黏度无明显变化；以部分插入方式与ＤＮＡ作用时，则可能使ＤＮＡ双螺旋发生扭结，使其黏度减少。邓洪等［２７］用黏度测定研究了钌多吡啶配合物与小牛胸腺ＤＮＡ的相互作用。结果表明，配合物Ｒｕ１和Ｒｕ２通过ＣＹＩＰ［２（４ｃｙａｎｏ）ｉｍｉｄａｚｏ（４，５ｆ）１，１０ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ］配体以插入的方式与ＤＮＡ结合，而配合物Ｒｕ３和Ｒｕ４则通过ＣＯＩＰ［２（２ｃｙａｎｏ）ｉｍｉｄａｚｏ（４，５ｆ）１，１０ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ］配体以部分插入的方式与ＤＮＡ结合。１５ＮＭＲ谱ＮＭＲ谱能够直接提供配合物和ＤＮＡ键合的详细信息，用于更深层次上探测小分子化合物与ＤＮＡ的键合机制及作用位点（如ＤＮＡ的大沟、小沟或碱基位置的特异性结合等）。有人利用这一技术研究了手性配合物△△和ΛΛ［Ｒｕ（ｂｐｙ）２（ｂｄｐｔｂ）Ｒｕ（ｂｐｙ）２］４＋与小牛胸腺ＤＮＡ的相互作用。表明△△和ΛΛ［Ｒｕ（ｂｐｙ）２（ｂｄｐｔｂ）Ｒｕ（ｂｐｙ）２］４＋均以插入方式与ＤＮＡ的大沟处结合，但△△异构体的插入深度不如ΛΛ异构体［２８］。利用该技术对Ｐｔ的二氨基羧酸复合物和乙基酯衍生物与ＧＭＰ（ｇｕａｎｙｌｉｃａｃｉｄ）和ＤＮＡ相互作用研究证明配合物结构中配基环的大小对抗肿瘤活性有很大的影响［２９］。Ｔａｒｅｋ等［３０］对蒽醌类抗肿瘤活性药物进行研究，当蒽醌类形成ＣＴ（ｃｈａｒｇｅｔｒａｎｓｆｅｒ）复合物后是很好的电子供体，可用ＮＭＲ对它检测证明。通过对诺氟沙星与双链ＤＮＡ反应的ＮＭＲ研究，表明诺氟沙星不会使ＤＮＡ发生构像变化，且具有平面双环结构的诺氟沙星一部分以插入方式进入ＤＮＡ，还有部分为非特异性键合［３１］。１６共振光散射光谱（ＲＬＳ）ＲＬＳ技术应用于生物大分子分析是近几年才发展起来·２８４·ＣｈｉｎＰｈａｒｍＪ，２００５Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ４０Ｎｏ７中国药学杂志２００５年４月第４０卷第７期的。测定的基础是药物分子在核酸大分子表面进行堆积导致强烈的共振光散射增强，共振光散射信号的增强与生物大分子的浓度具有线性关系。研究报道中大多利用核酸增强阳离子染料探针的共振光散射强度，据此研究核酸与探针间的相互作用以及对核酸进行定量测定。该分析方法快速简便，线性范围宽，灵敏度高，测定干扰小，应用合成样品测定结果令人满意。近年报道的有机染料包括甲酚蓝、罗丹明、副品红、中性红、结晶紫、亚甲基蓝、亮绿、酚藏花红、锰酞菁、孔雀石绿等。国内近年关于ＲＬＳ报道很多，方光荣等［３２］研究了咕吨类染料丁基罗丹明Ｂ（ＢＰＢ）与ＤＮＡ作用的共振光散射光谱，考察了影响因素和最佳反应条件，建立了用ＲＬＳ测定纳克级ＤＮＡ的新方法。肖忠柏等［３３］用新合成了稀土镧的混配物ＬａＬ１Ｌ２·３Ｈ２Ｏ（Ｌ１为邻苯二甲酸，Ｌ２为邻菲咯啉），该配合物与ＤＮＡ作用后，导致共振光散射增强，测定背景干扰小。有人对ＲＬＳ的ＤＮＡ检测技