蛋白质聚焦层析

L/O/G/O蛋白质聚焦层析谷春娇马力任重王聪定义•聚焦层析是一种操作简单、廉价的柱层析技术•其流动相为多缓冲液，固定相为多缓冲交换剂•利用层析过程中固定相偶联的具有两性解离功能的有机分子为配基，与流动相中某些两性物质发生等电聚焦反应而进行的一种分离方法•等电聚焦聚焦层析•柱层析发展优点有聚焦作用，蛋白峰尖、带狭，带宽度为0.04~0.05pH单位在柱内自动形成pH梯度，不需要pH梯度装置操作方便分辨率高4123近年来，由瑞典Pharmacia公司设计了一种新的分离技术，叫做聚焦层析(Chromatofocusing)，其产品已经实现量产以及商业化其优点如下：多缓冲液(Polybuffer)•属于两性电解质一类的缓冲液•含有多种缓冲液•用NaOH滴定的滴定曲线近似平滑的直线•该公司有Polyboffer96和Polybuffer74两种产品，即分别代表缓冲力范围为pH9-6和pH7-4多缓冲液离子交换树脂(polybufferexehangers)•带有碱性缓冲基团的阴离子交换树脂•把带电基团通过醚键与Sepharose6B的单糖连接的•也有两种产品：PBE94、PBE118应用范围分别是pH9-4和pH11-8•但后者要与两性电解质Pharmalyte（pH8-10.5）联合使用梯度溶液的形成•聚焦层析介质上偶联的多氨基多羧基的有机分子，具有相应的酸性和碱性离子交换基团•这些基团本身所带的正负电荷与缓冲液中的氢离子和氢氧根离子作用而形成的pH梯度•在层析过程中能与溶液中某些阴离子或阳离子发生聚焦反应，聚焦在不同区域，使物质得到分离。梯度溶液的形成•例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含pH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体•这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用•随着淋洗液的不断加人，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降•照此处理一段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6-9的梯度。梯度溶液的形成•但是随着淋洗的进行，pH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的pH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的pH梯度也就消失了蛋白质的行为•蛋白质所带电荷取决于它的等电点（pI）和层析柱中的pH值•当柱中的pH低于蛋白质的pI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗时间延长而变化的•当蛋白质移动至环境pH高于其pI时，蛋白质由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合蛋白质的行为•由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH再次低于pI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来•随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的•不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的聚焦效应•蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应•pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件•如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处•从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出聚焦效应•若在此蛋白质样品被洗出前，再加人第二份同种蛋白质样品时，后者将在洗脱液的作用下以同样的速度向前移动，而不被固定相吸附，直到其迁移至近似本身等电点的环境处（即第一个样品的缓慢迁移处）•然后两份样品以同样的速度迁移，最后同时从柱底洗出聚焦层析的介质•大多数都是以交联的琼脂糖凝胶为载体，通过共价键结合将多氨基多羧基化合物偶联到琼脂糖凝胶载体上•目前用的较多的层析介质是多聚缓冲液交换剂（固定相）PBE118，PBE94，前者属于偏碱性层析介质（pH8-11），后者属于中性层析介质（pH4-9）•常用多缓冲剂（流动相）有Polybuffer96和Polybuffer74（分别在pH6-9和pH7-4范围内有较强缓冲能力•如将他们混合在一起，则较强缓冲能力的pH范围为4-9缓冲液和交换树脂的选择•缓冲液和多缓冲液交换树脂每次最大操作范围是3pH单位•若是样品的pl是已知的，只要选择对应的pH缓冲液和树脂即可，最好洗脱位置在pH梯度的1/3-1/2以后•若是未知样品，应先定出pl值。也可用公司配套提供的聚焦层析试剂箱测定pI•一旦决定了pl，就可选择了缓冲液和交换树脂的选择•交换树脂量的选择是取决于样品数量，样品性质和杂质多少等，一般20~30毫升床体积可分离1-200毫克蛋白/pH单位操作•先将悬浮的多缓冲液交换树脂装柱。要求无气泡(可先脱气)•用一个高于多缓冲液pH的起始缓冲液平衡柱子。当流出液pH与起始缓冲液pH相同即可上样•样品溶在所选择的多缓冲液中，再用同样的多缓冲液洗脱。这祥各种蛋白在自己的pl处聚焦，并依次洗脱下来，分部收集操作•操作流程：•聚焦层析柱起始缓冲液平衡样液上样多缓冲液淋洗洗脱液解吸附注意事项•样品的基本性质–在聚焦层析前，样品最好能提供一些必要的参数，如：等电点、溶解度、稳定性等•样品制备要求–样品中不能含有盐或强离子型有机化合物，盐类等强电解质物质会影响聚焦效应蛋白质与多缓冲液的分离•一般多缓冲液不干扰酶的测活或氨基酸分析•虽然多缓冲液不影响考马斯亮兰反应，但与铜离子会形成复合物，所以干扰Lowry反应•如用Lowry反应测蛋白有必要将蛋白与多缓冲液分开。这时用硫酸铵沉淀法，凝胶过滤法或亲和层析法等都可以将蛋白与多缓冲液分开。再生•多缓冲液交换树脂的再生很容易，只要用2-3倍床体积的1MNaCl在柱内洗涤就行了•如果有强结合力的蛋白未除去，可用0.1MHCI洗涤，但要立刻用高pH溶液洗去HCI，再用所选择的起始缓冲液平衡后，即可使用应用简介聚焦层析最适合于分离某些蛋白质分子量和极性方面的性质十分相似，而等电点有区别的物质。尤其对用其他的层析方法难以分离的混合物，采用此法可得到较好的效果昆虫谷胱甘肽S-转移酶β-乳球蛋白A型和B型的分离人血清载脂蛋白CⅢ亚型的分离123Ⅲ亚型的分离•华西医科大学基础医学院方定志等利用此方法分离了人血清载脂蛋白CⅢ亚型•他们用密度梯度超速离心法,从混合人血清中分离极低密度脂蛋白，经脱脂后再进行聚焦层析分离其中的载脂蛋白。获得的纯品载脂蛋白CⅢ1和CⅢ2经等电聚焦电泳均呈现一条带具体操作•将100mlPBE94混悬于100ml平衡缓冲液(25mmol/L咪唑,7.2mol/L尿素,1mmol/LNa2EDTA,pH7.4)装入1.5cm×75cm层析柱•于4℃用10倍床体积平衡缓冲液平衡后,用溶解的apoVLDL(含蛋白45~50mg)上柱•然后于4℃用1000ml洗脱缓冲液(polybuffer74∶8mol/L尿素为1∶8，pH4.0)洗脱,形成pH梯度•洗脱速度为20~25ml/min，每管2.5~3.0ml分部收集•测定各管280nm紫外光吸收值,收集各蛋白峰•经HTP柱层析除去polybuffer，最后对标准透析缓冲液(20mmol/LTris-HCl,0.85%NaCl,0.01%Na2EDTA,0.01%NaN3,pH7.4)于4℃透析转移酶的分离•北京大学生命科学学院的周先碗在分离纯化昆虫谷胱甘肽S-转移酶过程中也用到了聚焦层析具体操作•首先将冷冻的蜡螟幼虫在磷酸缓冲液中匀桨,经10000g和100000g分级离心•取上清液通过QAE-SephadexA-25离子交换柱层析除去部分色素和杂蛋白•然后采用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶亲和层析(GSH-QT4),四溴酚酞二磺酸盐-琼脂糖凝胶亲和层析(BSP-QT4),铜离子-琼脂糖凝胶螯合层析(Cu2+-QT4)及PBE94-Sepharose(PBE94)聚焦层析等层析技术进一步分离纯化•将上述方法获得的色谱峰以CDNB和DCNB为底物检测生物活性•具有生物活性部分的蛋白质,通过SDS-PAGE测定其分子量型的分离•美国一所大学应用阳离子型聚焦层析分离A型和B型β-乳球蛋白•A型和B型分子量都是36000，等电点仅差0.1•A型等电点为5.1B型为5.2型的分离•PolyCATA柱，上样量为0.5mg的β-乳球蛋白•预饱和缓冲液由10mM柠檬酸组成，用NaOH滴定到pH2.6。•洗脱液pH6.5，流速为1.5ml/min，即可达到两者的分离•13分钟时得到的是β-乳球蛋白A，16分钟是β-乳球蛋白B!