实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用

2013-11-26实时荧光定量PCR技术的原理及应用（RealTimeQuantitativePCR）Contents一、实时荧光定量PCR的定义二、RT-PCR技术的原理及试验流程三、RT-PCR技术的数据分析四、RT-PCR技术的应用实时荧光定量PCR目录PCR电泳实时荧光定量PCR的定义普通PCR在PCR结束后对进行定量分析终点产物PCR技术和荧光检测技术的结合通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好2、EB有毒，荧光太贵等缺点实时荧光定量PCR的定义PCR技术和荧光检测技术的结合通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。实时荧光定量PCR的定义RT-PCR技术的原理及试验流程RT-PCR技术的原理及试验流程RT-PCR反应体系模板4.5μlTagmixture5.0μlF(F’)0.25μlR(R’)0.25μl荧光染料SYBRGreenI荧光标记的探针TaqMan探针法RT-PCR技术的原理及试验流程MonitoringPCRwiththeSYBRGreenIDye（SYBRGreen法）变性退火延伸RT-PCR技术的原理及试验流程SYBRGreen法优缺点RT-PCR技术的原理及试验流程RT-PCR技术的原理及试验流程MonitoringPCRwithTaqMan（TaqMan法）RT-PCR技术的原理及试验流程TaqMan法TaqMan探针法优缺点RT-PCR技术的原理及试验流程•绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究•相对定量(RelativeQuantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究RT-PCR技术的数据分析相对定量通过内标定量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量RT-PCR技术的数据分析内标（EndogenousControl）通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小PCR分四个阶段RT-PCR技术的数据分析如何定量？RT-PCR技术的数据分析-ΔΔCtPCR扩增循环数扣除背景荧光后的相对荧光量1.荧光域值（threshold）的设定在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。如何定量？RT-PCR技术的数据分析-ΔΔCtPCR扩增循环数扣除背景荧光后的相对荧光量2.Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图所示）。如何定量？RT-PCR技术的数据分析-ΔΔCt3.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。PCR扩增循环数扣除背景荧光后的相对荧光量RT-PCR技术的数据分析3.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。RT-PCR技术的数据分析相对定量分析方法-ΔΔCt前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（control)=CT（target,control)-CT（ref,control)2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：ΔΔCT=ΔCT（test/control)-ΔCT（calibrator)3、计算表达水平比率：相对表达量RQ=2–ΔΔCTRT-PCR技术的数据分析SYBRGreen熔解曲线分析RT-PCR技术的数据分析•临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。•动物疾病检测：禽流感、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。•食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。•科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。•应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。RT-PCR技术的应用