现代生物技术制药工艺学

现代生物技术制药工艺学第一讲生物技术制药概论第二讲基因工程生物构建第三讲基因工程菌发酵制药工艺第四讲基因工程动物细胞培养制药工艺第五讲基因工程药物检测与质量控制第一讲生物技术制药概论第一节生物技术药物一、生物技术药物1.分类生物技术药物：利用生物机体、组织、细胞，生产制造或从中分离得到的具有预防、治疗和诊断功能的药品，包括具有生物活性的初级代谢和次级代谢产物、天然活性化合物及其类似物。生物药物：20世纪80年代，用现代生物技术生产的治疗性药物，基于重组DNA技术和杂交瘤技术生产的药物，不包括直接从天然组织、血液等中提取的治疗性蛋白质。随着生物技术的发展，以核酸为基础的治疗性药物也属于生物药物。除了治疗性药物外，也包括体外诊断试剂。在制药领域，生物技术药物、生物技术产品、生物技术制品互换使用。美国制药研究与制造者（PhTMA）在其相关的报告中经常使用生物技术药物。生物技术药物包括重组DNA、单克隆抗体、杂交瘤和细胞系生产的药物，也包括细胞和组织来源的药物及基因治疗药物。虽然与生物药物的范畴有重叠，但生物技术药物的范围更大。生物药物是15～20年以前药物的一个亚类，生物技术药物的历史较长、含义广。生物技术就是整合自然科学和工程科学，获得应用生物，生产细胞产品和分子产品。所以生物技术药物应该包括任何生物技术手段和方法（部分或全部）生产的药物，包括传统生物技术方法，如非重组蛋白，从天然资源如微生物中分离提取的抗生素或半合成抗生素，植物来源的提取药物和细胞培养药物。按照来源可把生物技术药物分为微生物药物、植物药物和动物（包括人）药物等。制造工艺：化学合成药物、生物合成药物、半合成药物和中药制造生产技术:微生物发酵药物、植物组织培养药物、动物细胞培养药物、动物组织和血液制剂药物、免疫抗体药物等。化学本质和特征：重组药物、基因药物、天然药物和合成、半合成药物。重组药物：重组多肽和蛋白质药物、细胞因子、受体、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗和重组多价疫苗等。基因药物：反义核酸药物、基因治疗药物、DNA疫苗和核酶等。天然药物：来自动物、植物、微生物和海洋生物的天然产物。生化药物：包括从动物组织或脏器等中分离提取的氨基酸类、多肽和蛋白质类、酶与辅酶类、核酸及其衍生物类、多糖类、脂类、生长因子类等药物生物技术药物生物药物重组蛋白质是是单克隆抗体是是天然材料中直接提取的多肽、蛋白质是否治疗性基因药物是是反义寡核苷酸（直接化学合成）是否反义寡核苷酸（生物酶法合成）是是直接化学合成的多肽否否天然材料中获得的抗生素、半合成抗生素是否植物来源的天然药物或半合成药物是否细胞或组织制剂是否在有关法规中，经常出现的术语是生物制品(中国、美国使用)或生物反应修饰剂（美国使用）、生物医药产品（欧盟使用）。美国FDA对生物制品的定义是病毒、治疗性血清、毒素、抗毒素、疫苗、血液、血液成分及其衍生物、变应原性制剂及类似产品、胂凡钠明及其衍生物，用于预防、治疗疾病。这个定义并没有包括所有生物来源的药物。传统的生物制品包括疫苗、类毒素、血液制品和代谢制剂，但现在也包括重组蛋白质和核酸药物。生物反应修饰剂是激素、神经活性物质、免疫活性物质的总称，它们在细胞水平上起作用。中国的生物制品规程也对生物制品的定义：以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂，包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗体、变态反应原、细胞因子、激素、酶、发酵产品、单克隆抗体、DNA重组产品和体外免疫诊断制品等。生物制品分类：预防用生物制品治疗用生物制品诊断用品菌苗抗血清与抗毒素细菌学试剂疫苗血液制品免疫试剂类毒素细胞因子临床化学试剂2.重要的微生物药物抗生素：链霉素，头孢霉素；链霉菌，青霉菌氨基酸：谷氨酸等20余种，放线菌，真菌维生素：维生素A，B2，霉菌，丙酸菌，酵母核苷酸和核苷：肌苷酸和肌苷，杆菌，放线菌，酵母，青霉酶：淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，天门冬酰胺酶，链激酶，葡激酶；米曲霉，黑曲霉，链霉菌酶抑制剂：洛伐他丁，辛伐他丁；曲霉，链霉菌免疫调节剂：环孢菌素A；光泽柱孢菌，链霉菌抗生素:一类在低浓度下就能选择性地抑制或影响其它生物的生命过程的次级代谢产物。天然抗生素约9000种，半合成抗生素有7000多种，具有临床应用价值的近500种，已经大规模工业生产的抗生素达100多种。种类药物举例生产菌抗菌机理与应用β内酰胺类头孢霉素头孢霉抑制细胞壁氨基糖苷类链霉素链霉菌抑制蛋白合成大环内酯类红霉素链霉菌抑制蛋白合成多烯类两性霉素链霉菌破坏细胞膜四环素类四环素链霉菌抑制蛋白合成糖肽类万古霉素无枝酸菌抑制细胞壁多肽类杆菌肽杆菌破坏细胞膜蒽环类柔红霉素链霉菌抑制RNA和DNA合成。3.重要的植物药物很多植物来源的药物已经能化学合成，还有一部分直接分离提取，或修饰加工的半合成药物。其中部分已经用植物细胞大规模培养进行生产。生物碱：阿托品，可卡因，吐根，奎宁，长春碱，长春新碱，喜树碱，秋水仙碱水杨酸：阿司匹林；萜类:紫杉醇香豆素:双香豆素甾体:地高辛，洋地黄苷酶：脲酶,无花果蛋白酶4.重要的动物药物从动物组织或器官中直接分离提取，蛋白质类药物可以用基因工程技术制造，非蛋白质药物包括甾体类激素、皮质类甾体和前列腺素等，大多数已化学合成。胰腺：胰岛素，高血糖素，胰蛋白酶，胰酯酶，胰凝乳酶，Dnase，弹性蛋白酶脑：脑磷脂，神经磷脂垂体：生长素，促黄体激素，加压素，促卵泡激素，促皮质激素肝脏：维生素，肝细胞生长因子，肝素，RNA胸腺：胸腺素，胸腺肽血液：凝血酶，凝血因子，血红素，血红蛋白，SOD，血浆，白蛋白，免疫球蛋白，纤溶酶甲状腺、鳃：降钙素胃黏膜：胃蛋白酶，胃膜素，双岐因子，凝乳酶尿：绒膜促性激素，尿激酶心脏：细胞色素C，辅酶Q蛋清：溶菌酶二、重要的重组生物药物1.激素类药物激素是由内分泌腺或特异细胞产生的含量极低一类小分子，通过信使功能，起专一生理效应。人胰岛素：胰岛细胞，前胰岛素原跨膜运输，切除23aa信号肽，86aa的胰岛素原。高尔基体形成二硫键，切除C肽，成熟的胰岛素分泌到胞外，进入血液循环。成熟的胰岛素由AB双链组成，A链21aa，B链30aa，3对二硫键。生理功能广泛，能促进糖原合成和糖酵解，产生ATP，降低血糖含量，保持能量供应。重组人胰岛素:发达国家取代猪或牛胰岛素，用于临床，主要治疗I型糖尿病。生长素:垂体前叶分泌的一种促进生长的激素。人生长素是191aa的单链球蛋白，2对二硫键。生长素具有促进氨基酸的运输和蛋白质、核酸的合成代谢，刺激新骨形成和红细胞生成，加速生长。重组人生长素用于治疗侏儒病、慢性肾功能衰竭、烧伤、创伤等。心钠素即心房利钠多肽（心房利钠因子）：是一个家族，心钠素、脑钠素、C型利钠肽。心钠素家族的三个成员分子为环状结构，N端和C端为链状，1对二硫键在环内，存在高度保守序列和区域。人心钠素由28个氨基酸残基组成，人脑钠素由32个氨基酸残基组成。重组人心钠素日本上市，用于心衰治疗，我国也进入临床实验。降钙素:甲状腺滤泡旁细胞产生的激素，生理功能是调节钙磷代谢，维持内环境的稳定。33aa的多肽激素，不同种类活性差异较大，非脊椎动物如鱼类比哺乳动物的活性高。目前使用的是天然提取的猪、人、鳗鱼、化学合成的等。基因工程重组鲑鱼钙降素于1999年在欧洲上市。主要用于骨质疏松、高钙血症、Paget’s病等，骨量减少，更新机能障碍等疾病的治疗。高血糖素：低血糖症；促甲状腺素：治疗和诊断促卵泡激素：停止排卵和超排卵种类商品名胰岛素Humulin，Novolin，Humalog，Lantus生长素Humatrope，Nutropin，Saizen,BioTropin，Genotropin，Norditropin，Protropin,Serostim高血糖素Glucogen促甲状腺素Thyrogen促卵泡激素ConalF，Puregon,Follistin2.细胞因子药物细胞因子：各种细胞合成并分泌的小分子多肽类因子，调节机体的生理功能，参与细胞的增殖、分化、免疫、移植排斥、凋亡等过程。干扰素：IFN-α，β，γ，εω，τ。IFN-α约有25种亚型，165－166aa，2个二硫键，无N－糖化位点。IFN-β有4个亚型，166aa，1个二硫键。IFN-γ有4以上个亚型，由143个氨基酸残基组成，无二硫键，2个N－糖化位点。重组α、β、γ干扰素均已上市，α治疗白血病、慢性病毒感染如乙肝、丙肝、单纯疱症病毒等，β治疗多发性硬化症，γ治疗类风湿关节炎等。白细胞介素:介导白细胞之间相互作用的一些细胞因子,现已命名至IL－23。只有IL-2和IL-11被开发成基因工程药物而上市。IL－2由133aa组成，1个链内二硫键，糖蛋白。IL－11由178aa组成，无二硫键和糖基化。IL－2用于癌症辅助治疗，IL－11与G－CSF联合使用，纠正化疗导致的粒细胞和血小板减少症。集落刺激因子:是指能刺激造血细胞在半固体培养基上形成细胞集落的细胞因子，是一类造血细胞生长因子。M－CSF，GM－CSF，Multi－CSF，EPO，SCF，TPO等。粒细胞集落刺激因子G-CSF是174aa，2对二硫键。GM-CSF是127aa，2对二硫键。M-CSF是522aa，3对二硫键。它们都具有N－糖化位点，有信号肽，分泌时被切除。重组人G-CSF、GM-CSF、M-CSF均已上市，刺激骨髓中粒细胞和巨噬细胞增殖，集落形成，增强免疫，用于血细胞减少症、再生障碍性贫血及化疗放疗癌症的辅助治疗。EPO是165aa的高度糖基化蛋白，2个二硫键，糖基（主要为唾液酸）对活性至关重要。重组EPO用于治疗透析性贫血或其他贫血，是治疗肾功能衰竭导致贫血的首选药物。SCF:重组人SCF主要作用于早期造血干细胞，范围广，但专异性差，还具有种属特异性，单独使用活性低。可与其他因子协同作用产生不同的联合效应。一般与G-SCF联合使用，刺激粒细胞增殖。与EPO联合，刺激早期红细胞的增殖，对细胞肥大也有增殖作用。生长因子GF:对细胞生长具有促进作用的因子，表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、转化生长因子TGF、血小板生成素TPO。EGF：53aa，3对二硫键。重组人EGF已在国内外上市，大肠杆菌和酵母细胞表达。主要外用，治疗烧伤、溃疡和外伤及外周神经系统疾病。FGF：碱性成纤维细胞生长因子bFGF和酸性成纤维细胞生长因子aFGF，等电点分别为5.4和9.8，它们的生物学活性相似。其实FGF是一个家族，其成员已经鉴定出22个，重组FGF主要外用，治疗烧伤及外周神经系统疾病。TNF：肿瘤坏死因子，杀灭肿瘤。巨噬细胞产生TNF-α，T细胞产生TNF-β。TNF具有广泛生物学效应，参与免疫细胞激活和炎症反应，具有抗感染、抗病毒、抗肿瘤的作用。国外重组TNF已进入临床阶段，用于肿瘤治疗，与化疗联合使用。TPO：332aa。重组TPO已进入临床阶段，主要用于肿瘤病人的化疗所致血小板减少症。种类商品名IFN-α1b赛诺金，干扰灵IFN-α2aReferonA，福康泰，来福隆，迪恩安，因特粉，贝尔芬IFN-α2bIntronA，Rebetron，Alfatronol，Virtron，安达芬，隆化诺，保守IFN-αInfergenIFN-βBetaferon，Betaseron，Avonex，RedifIFN-γ1bActimmuneIL-2Proleukin，辛格尔，德路生，悦康仙，英路因，安特鲁克IL-11NeumegaEPOEpogen，Procrit，Neorecormon，宁红欣，依普定，益比奥GM-CSFLeukine，里亚尔G-CSFNeupogen，吉粒芬PDGFRegranexTNF-αBeromun3.溶血栓药物类溶血栓药物是纤溶酶原激活剂PA通过激活无活性的血浆纤溶酶原PLG，形成有活性的纤溶酶PLM.催化血栓的主要基质纤维蛋白水解，使血栓溶解，畅通血管。纤溶酶原激活剂有:组织型纤溶酶原激活剂tPA;尿激酶原激活剂u