生物技术制药第六章 植物细胞制药

第六章植物细胞制药第一节概述人们利用植物作为药物已有几千年的历史，尤其是我国对中草药的应用。近年来，随着对植物药物的重视程度的不断提高，人们力图从植物中寻找高效、低毒和廉价的药物，以攻克许多危害人类健康的疾病，癌症、爱滋病等高等植物的次生代谢产物是丰富多样的，在医药、食品、化工和农业等许多领域作为原料已得到应用。我们所利用的植物代谢产物多为混合物，所以掌握其比例很关键，对于单一成分的活性物质，人们企图通过化学合成的方法来制备，但由于收率低、费用高、化学合成困难，并且需要进行异构体的拆分，使得合成难以进行。目前，植物仍然是多种活性化合物的最丰富的来源。由于植物的生长周期长，代谢成分复杂等因素的限制，利用植物获得大量活性物质也受到影响，现在，通过植物细胞的大量培养可以解决这一问题。现阶段植物细胞的培养技术还很不完善，成本较高，今后如何提高单位培养基中有用物质的产量、降低目的产物的生产成本就成为利用植物细胞培养技术生产天然药物并实现工业化生产的关键所在。包括改进培养条件、筛选高产细胞株、研制适合于植物细胞大量培养的新型生物反应器一、植物细胞制药概况二、基本概念1.植物组织和细胞培养：指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的细胞、组织和器官的生长以及控制其生长发育的技术植物无菌培养包括：①植物培养：幼苗及较大植株的培养②愈伤组织培养：从植物体各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养③悬浮培养：能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养④器官培养：离体器官的培养⑤胚胎培养：未成熟或成熟的胚胎的离体培养2.悬浮培养在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体（细胞团）的培养（在此培养条件下，组织化水平较低）3.细胞培养利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化（目的是为了得到单细胞无性繁殖系）4.分生组织培养又称生长锥培养，在人工培养基上培养茎端分生组织细胞5.外植体用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养6.器官形成是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽和根之后，再形成锥管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株7.无性繁殖又叫克隆，指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代8.突变体细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”，连续多代的培养就称为继代培养继代培养有时也称为连续培养，但“连续培养”多用于不断加入新的培养基，并连续收集培养物，以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养技术9.继代培养10.次级代谢和次级代谢产物初级代谢产物：包括核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类等次级代谢产物：除初级代谢产物外，具有如下特征的成分①有明显的分类学区域界限②其合成需在一定的条件下才能发生③缺乏明确的生理功能④是生命的多余成分如生物碱、蒽醌、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等二、植物细胞培养的发展简史①19世纪上半叶，提出了细胞学说，20世纪初叶，德国著名植物学家依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞。20世纪20年代初至30年代，胚胎培养和器官培养取得了一些成果②30年代末至40年代，植物细胞器官与营养需求之间的关系③40年代末至50年代，确定了腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一④60年代初，分离出植物的原生质体⑤60至70年代中叶，开发培养基和研究培养方法⑥75-85年，优化细胞生长和次级代谢产物形成⑦20C90Y以来，应用分子生物学技术，结合新型生物反应器，成功培养出了多种新药成分；如利用红豆衫细胞培养生产抗癌新药“紫杉醇”第二节植物细胞的形态和生理特性一、形态1.植物细胞形状多种多样，球形、类圆形、椭圆形、角形；具有支持作用的细胞细胞壁常增厚，类圆形、纺锤形；具有输导作用的细胞管形2.细胞大小不一，基本组织细胞体积较大直径在20-100微米之间，储藏组织细胞的直径可达1毫米，最长的细胞是无节乳管长达数米至数十米二、结构特征(一)植物细胞分类原核细胞根据典型细胞核的有无真核细胞（二）结构特征细胞壁植物细胞细胞核原生质体细胞质胞液原生质后含物的存在部位三、细胞后含物和生理活性物质细胞中除含有生命物质原生质体外，还有许多非生命物质，细胞的代谢产物，一类是后含物，储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，糖类、盐类、生物碱、苷、有机酸、挥发油等，另一类是生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用1.细胞后含物生物碱，含氮有机化合物，中药含有多种生物碱，麻黄碱，咖啡，阿托品，黄连素糖苷类，某些化合物和糖经糖苷键结合而成，对疾病有很好的治疗作用挥发油，具有芳香气味，薄荷油、丁香油和桉油有机酸，糖类代谢的中间产物，苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸。2.生理活性物质对细胞内生化反应和生理活动起调节作用酶类，生物催化剂维生素，参与酶的形成，对生长、呼吸、物质代谢有调节作用植物激素，调节代谢抗生素和植物杀菌素，杀死和抑制某些微生物生长的物质四、植物培养细胞的生理特性①植物细胞重量的增加主要在对数期，次级代谢产物的累积主要在稳定期②纤维素细胞壁导致植物培养细胞外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切力能力小，故传统的搅拌式生物反应器易损坏植物细胞的细胞壁③植物细胞都是好气的，培养过程中需要不断供氧④由于入射光在培养基中的穿透性不强，导致植物培养细胞光合作用效率低，故碳源仅很少一部分由光合作用提供，主要由培养基提供第三节植物细胞培养的基本技术一、植物材料的准备用于植物组织培养的外植体必须无菌，如果含有其他微生物，在培养基中，其他微生物会大量迅速繁殖从而影响植物组织的培养常用表面灭菌试剂的特点是灭菌后易于除去或容易分解的试剂，根据所处理材料对灭菌试剂的敏感性选择适当的处理时间常用灭菌试剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处理，时间为5-30分钟。氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间不宜过长，以免杀死植物细胞，当其用于休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为0.1%，2-10分钟，种子皮较厚时可延长至20分以上二、培养基及其组成培养基是植物离体器官、组织或细胞的无菌土壤，营养成分可调控植物细胞或组织培养基常含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等成分（表6-6列出了几种常用培养基的化学组成）无机盐中含有大量元素和微量元素。30mg/L为界限，大量有氮、硫、磷、钾、镁、钙、氯、钠。微量有铁、锰、碘、钼、铜、锌。磷的消耗很快，但机体自身可产生磷可满足需要，氮常以铵盐或硝酸盐形式提供。钾、镁、钙离子对细胞代谢必不可少；镁离子参与多种辅酶和激活子的合成；钾离子、钙离子可抑制某些酶的活性，有时钙离子也可保持某些酶的活性或稳定性。微量元素的作用是参与辅酶的形成，并可诱导酶的合成1.无机盐2.碳源常用碳源为碳水化合物、肌醇、甘油、乳糖和半乳糖。天然提取物如椰子乳、对愈伤组织的诱导和培养也有重要意义3.植物生长调节剂植物激素是植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（小于1微摩尔）时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用常见的植物激素有生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯。愈伤组织或细胞的生长和生存依赖于合成的生长素或天然生长素，可诱导特异酶类。植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和分裂素的比例，比值高可刺激细胞生长，比值低则刺激细胞分裂。但过量的赤霉素或酚类化合物可掩盖上述现象。对于植物培养细胞，绝大多数培养基中都必须加入一定量的生长调节剂4.有机氮源常用蛋白质水解物或各种氨基酸，有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸的加入是为了代替或增加氮源的供应5.维生素通常是维生素自养型，但大多数不能满足需要三、培养方法原生质体培养按培养对象分单细胞培养固体培养按培养基类型分液体培养悬浮培养按培养方式分固定化细胞培养培养方法固体培养包括琼脂培养和固定化培养优点：简便易行、所占空间小缺点：①随着培养的进行，培养基中营养物质产生浓度差，进而导致愈伤组织生长不平衡②外植体基部插入培养基中，该处气体交换不畅，阻碍了组织呼吸正常进行，同时植物生长过程中排出的有害物质的堆积会影响生长③由于重力作用或光线的入射局限性，导致愈伤组织细胞间出现极化现象，结果导致细胞群体不均匀状态④改变培养条件后，固体培养物的一些生理生化指标有时会发生改变固体培养的特点培养温度为25℃左右；常需光照，16h/d，光强几百~几千LX。由于植物组织在培养基上生长时要不断消耗养分、散失水分和累积代谢产物，因此外植体在培养周左右必须移至新鲜培养基上，以保持继续生长。移换一次培养基成为一次继代培养，经过一定次数的继代培养，其培养物可用于悬浮培养。液体培养系统包括悬浮培养和成批培养，半连续和连续培养。悬浮培养有静止培养和振荡培养（1）定义：将培养基一次性地加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的方式（2）生物反应器（图6-3）：最适于植物细胞培养的当属气升式反应器优点：用通气代替搅拌，避免了使用机械搅拌所致的细胞破碎、通气受限制、培养物易被污染等缺点，细胞产量也明显提高另外，在植物细胞培养过程中，由于次级代谢产物的大量累积发生在细胞生长稳定期，人们设计了植物细胞的两步培养法；即使用两个反应器，第一个用于细胞生物量的累积，第二个用于次级代谢产物的生产（两个反应器中培养基的营养组分不同）如日本科学家就是利用此方法开发出了世界上第一个植物细胞工程商品——紫草素。通过提高第二个反应器中Ca2+浓度的方法，大幅度增加了培养液中紫草素含量，从而实现了利用生物工程法生产紫草素的工业化1.成批培养法定义：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法半连续培养可看成是一种具有定时进出装置的成批培养系统。当培养进行到一定阶段时，每天或每隔两天收获一部分培养物，然后加入新鲜培养基，通过调整收获细胞的数量和次数来保持细胞重量的恒定2.半连续培养法3.连续培养法定义：利用连续培养反应器，在投料和接种一段时间后，以一定的速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境维持恒定的培养方法特点：①培养时间长，细胞生产能力比成批培养法高②细胞生长缓慢，培养时间长，需要维持系统的无菌状态，技术条件要求较高4.固定化培养法最适合植物细胞培养的方法定义：利用固定化反应器进行培养，将细胞固定于网状多孔板、尼龙网套和中空纤维膜等反应器的膜表面，放入培养液中进行培养及连续收集培养物的方法优点：细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体和维持细胞间的物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得次级代谢产物第四节影响植物次级代谢产物累积的因素影响次级代谢产物产生和累积的因素1.生物条件：外植体、季节、休眠、分化等2.物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（氧气）、酸度和渗透压3.化学条件：无机盐、碳源、物质生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质和前体等4.工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方式一、外植体的选择如图6-2，不同外植体在进行组织或细胞培养时，其次级代谢产物的累积时间各不相同（但是一般情况下，植物次级代谢产物的最高累积时间在细胞生长的稳定期）二、培养条件的影响培养条件包括：营养成分、生物及非生物元素、酸碱度、通气及混合程度、与接种有关的因素以及剪切力、搅拌频率、温度和光照等次级代谢产物累积量=累积率×生物量（一）培养环境的内在因素1.接种和诱导外植体的大小直接影响所诱导的组织和细胞的生长（生物量），而且也关系到其次级代谢产物的生产能力（累积率）。外植体的前处理也可严重影响次级代谢产物的累积方式另外，次级代谢产物的产率（累积率）与外植体大小、细胞密度及营养