生物技术药物制剂与疫苗

L/O/G/O生物技术药物制剂与疫苗刘建洲2013-5-17Contents生物技术药物制剂概述蛋白质类药物制剂的处方与工艺蛋白质类药物新型给药系统蛋白质类药物制剂的评价方法4123section1Section2疫苗一、概述生物技术：是应用生物体或其组成部分，在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。生物技术药物制剂是指采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产的药品。•生物技术药物研究概况生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约40余种，正在研究的有数百种之多，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。我国已上市的基因工程药物和疫苗1995年白细胞介素-21996年α1b-干扰素α2a-干扰素α2b-干扰素1997年粒细胞集落因子红细胞生成素1992年乙型肝炎疫苗生物技术药物的结构特点与理化性质•蛋白质的组成和一般结构蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序排列，通过肽键相连而成的多肽链。•蛋白质的高级结构包括二级、三级与四级结构。蛋白质的理化性质1、蛋白质的一般理化性质•旋光性：由螺旋结构引起，通常为右旋•紫外吸收：苯核在280nm有最大吸收，氨基酸在230nm显强吸收•蛋白质两性性质与电学性质：在不同pH下会成为阳离子，阴离子或两性离子2、蛋白质的不稳定性•由于共价键引起的不稳定性蛋白质的水解蛋白质的氧化外消旋作用二硫键断裂及其交换•由非共价键引起的不稳定性：聚集宏观沉淀表面吸附蛋白质变性蛋白质的理化性质蛋白质的稳定性对于蛋白质类药物的制剂研究、生产、贮存等极为重要。蛋白质类药物的评价方法•液相色谱法：RP-HPLC,IEC,SEC•光谱法:UV,可见吸收光谱，ORD,CD,荧光，IR,拉曼光谱•电泳：SDS-PAGE,IEF,EC•生物活性测定与免疫测定:重组DNA和杂交瘤技术产品应进行生物活性的测定，蛋白质药物制剂的稳定性也应检测其生物活性。–生物活性检测是利用体内模型或体外组织或活性蛋白质多肽的特异性生物学反应，通过剂量（或浓度）效应曲线进行定量（绝对量或比活性单位）。–免疫测定通常采用免疫化学法在前面讨论蛋白质药物不稳定的原因时已经看出，要开发蛋白质类药物，需要多种分析方法。二、蛋白质类药物制剂的处方与工艺•蛋白类药物的一般处方组成蛋白类注射剂包括：–溶液型注射剂：使用方便，需低温保存–冻干粉注射剂：稳定，但工艺复杂•液体剂型中蛋白类药物的稳定化方法–改造其结构–加适宜辅料（通过加入各类辅料，改变蛋白类药物溶剂的性质是药物制剂中常用的稳定化方法。）蛋白质类药物制剂的研制关键是解决这类药物的稳定性问题。对于注射给药则采用适当的辅料，设计合理的处方与工艺，而非注射给药还需解决生物利用度问题。•蛋白类药物的稳定剂有–缓冲液：枸橼酸钠-枸橼酸缓冲剂，磷酸盐缓冲系统–表面活性剂：非离子型表面活性剂，如吐温80–糖和多元醇：蔗糖，海藻糖，山梨醇等–盐类：常用NaCl–聚乙二醇类：如PEG200、300、400、600、1000–大分子化合物：HSA(人血清蛋白)–组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等–金属离子：钙、镁、锌等固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺冷冻干燥蛋白质药物制剂•需考虑的问题：–选择适宜辅料–辅料对冷冻干燥过程中一些参数的影响•冻干保护剂：甘露醇，山梨醇，蔗糖，葡萄糖，右旋糖酐等喷雾干燥蛋白质药物制剂：喷雾干燥工艺广泛应用于蛋白质类药物的控释制剂、吸入剂、微球制剂等新型给药系统的研制中。在喷雾干燥过程中可加入稳定剂，如蔗糖能提高氧血红蛋白（oxyhemoglobin）的稳定性。缺点是操作过程中损失大，水分含量高高分子聚合物中蛋白质药物的稳定化•蛋白质药物稳定性–药物的不稳定性通常发生在制备、储存和释放过程中–蛋白质药物不稳定机理有：蛋白分子的伸展；水溶性或水不溶性聚集；水解；脱氨和氧化–在应用W/O/W复乳溶剂挥发法制备PLGA微球时加入稳定剂BSA或海藻糖可有效提高蛋白质稳定性。•包封在聚合物中的蛋白质药物在释放过程中影响稳定性的因素–含水量–微环境的pH–聚合物表面吸附–次要因素：水溶性低聚物，渗析效应，蛋白与聚合物之间的直接反应•使稳定性研究简化的途径和方法–模型蛋白的选用：如以核糖核酸酶A作为模型药物研究蛋白质不稳定性机理–聚合物中蛋白质结构的模拟和修饰：模拟蛋白质所处的不利条件以及不稳定机理可用以阐述在蛋白的提取过程之外的不稳定因素。–选用不同的聚合物骨架：采用较大几何形状的微柱体来简化蛋白质稳定性的研究与评价。•由湿度引起的不稳定性–改变固体药物中的含水量，是蛋白质处于非伸展状态以及直接阻断其不稳定机制。–锌离子与人生长激素形成不溶性沉淀可提高蛋白质稳定性–加入添加剂，可以改变聚合物的吸水量两种常见共价聚集的机制：•固体蛋白质在湿环境中二硫键的破环•由甲醛介导的聚集过程由酸诱导的蛋白不稳定性•提高PLGA包封蛋白稳定性的最直接方法是调节处方以提高微环境的pH值。•避免由酸诱导的BSA的物理聚集的方法–增加聚合物的通透性，从而使PLGA的水解产物——水溶性酸释放出来–降低聚酯的降解速率–加入适当添加剂，中和聚合物的降解产物——弱酸三、蛋白质类药物新型给药系统新型注射（植入）给药系统临床经验表明，很多蛋白质类药物在体内血浆半衰期短，清除率高，因而需要延长其在体内的平均驻留时间，或改变蛋白质在体内的药物动力学性质，有时需要制成非零级脉冲式释药系统（如疫苗）。为满足这些要求，既可以对蛋白质分子进行化学修饰，也可以控制蛋白质进入血流的释放速度等。目前已有用PEG修饰蛋白质分子以延长蛋白质药物在血浆中的半衰期。例如，腺苷酸脱氨酶（adenosinedeaminase，ADA）即采用形成PEG-ADA这种方法，治疗因ADA缺乏而引起免疫缺损综合征的患者，此药已经获FDA批准生产。•控释微球制剂：首次经FDA批准的蛋白质类药物微球制剂是醋酸亮丙瑞林（leuprolideacetate）聚丙交酯—乙交酯微球。此种微球供肌内注射，用于治疗前列腺癌，可控制释放达30d之久，改变了普通注射剂需每天注射的传统，使用方便。•控释微球制剂常用制备方法–复乳液中干燥法（γ干扰素、白细胞介素、亮丙瑞林、人生长激素、环孢素以及促红细胞生长素（EPO）等）–低温喷雾提取法–喷雾干燥法–超临界萃取法•脉冲式给药系统：如疫苗或类毒素等抗原蛋白白细胞介素1α（IL-1α）PLGA微球的制备：LimorChen等以改良的复乳溶剂挥发法制备。具体方法为：将含有20mg牛血清白蛋白（BSA）和8.5μgIL-1α的水溶液50μl与含有200mgPLGA的二氯甲烷0.5ml混合，用探针式超声乳化（56w）30s，将此初乳分散于1ml用二氯甲烷饱和的1%（w/v）PVA水溶液中，漩涡混悬形成复乳，再将该复乳倾入50ml0.1%（w/w）PVA水溶液中搅拌5min，再加入50ml含有10%（v/v）2-丙醇的PVA溶液将二氯甲烷抽提到外水相中，连续搅拌30min后，离心10min收集微球，冰冻干燥成流动性粉末状微球。由于皮下注射微球后小于10μm微球易被巨噬细胞吞噬，故需将微球粒径控制在10μm以上。制备过程中界面张力影响IL-1α的活性，加入0.5%（w/w）磷脂酰胆碱（PC）可保护IL-1α，并显著减小微球的粒径。微球的体外释放度试验表明，牛血清白蛋白和白细胞介素1α在30min钟内分别释放38%和63%，40d内分别释放75%和100%。扫描电镜显示，突释后的释药过程与骨架的溶蚀过程同时进行。非注射给药系统研究非注射途径的给药系统，将有益于增加病人的顺应性（compliance）。蛋白质和多肽类药物的非注射给药方式包括鼻腔、口服、直肠、口腔、透皮和肺部给药。目前最有应用前景的属鼻腔给药，然而口服给药还是最受欢迎的给药途径，但难度很大。•蛋白质和多肽类药物的非注射给药系统存在的主要问题是药物透过黏膜能力差，易受酶的降解，以致生物利用度很低。•提高生物利用度的方法：–对药物进行化学修饰或制成前体药物–应用吸收促进剂–使用酶抑制剂–采用离子电渗法皮肤给药•鼻腔给药系统•鼻腔黏膜的特点：•鼻腔给药系统存在的问题：•吸收促进剂动静脉和毛细淋巴管丰富，大量微小绒毛，穿透性高，酶少，有利于药物吸收分子量大的药物透过性差，生物利用度低，吸收不规则，局部刺激性，妨碍绒毛运动，长期给药的毒性胆酸盐类，脂肪酸及其酯类，其他。•胰岛素鼻腔给药系统已进行广泛的研究，胰岛素不用促进剂经鼻腔给药生物利用度小于1％，但用葡萄糖胆酸酯作吸收促进剂，其生物利用度可提高到10％~30％。近年来有报道将胰岛素制成淀粉微球，微球直径45m，以0.751U／kg和1.71U／kg剂量喷入鼠鼻腔，达峰时为8min，30~40分钟后，血糖分别下降40％和64％，维持时间4小时，生物利用度约为30％。口服给药系统（胰岛素）存在问题：受胃酸的催化降解；受胃肠道内酶的降解；对胃肠道黏膜的透过性差；受肝脏的首过作用•微乳制剂：如自乳化的胰岛素油溶液•纳米囊和纳米粒：如胰岛素聚氰基丙烯酸异丁酯纳米囊•胰岛素肠溶胶囊•生物黏附材料与肠溶材料的联合应用技术：壳聚糖•胰岛素脂质体•新型吸收促进剂的应用：SNAC其他给药系统•直肠给药系统–特点：水解酶活性较低，pH接近中性，避免肝首过效应，一般采用吸收促进剂•结肠定位给药系统(OCDDS)•口腔黏膜给药系统：–避免胃肠消化及肝首过效应•经皮给药系统：–离子导入技术：指电荷或中性分子在电场作用下迁移进皮肤的过程。•肺部给药系统：–存在问题：长期给药后安全性评估；肺吸收分子大小的限值；促进吸收的措施；稳定的蛋白质药物的处方设计方法四、蛋白质类药物制剂的评价方法4.1制剂中药物的含量测定–提取技术：不能测定包括不溶性聚集蛋白在内的蛋白总量–水解技术：在碱性条件下的水解最为常用•含量测定方法：–紫外分光光度法–反相高效液相色谱法：RP-HPLC,IES,SEC法–BCA法和MicroBCA法4.2制剂中药物的活性测定•酶联免疫法–是建立在蛋白质类药物的活性部位与抗原决定簇处在相同部位时实施的一种方法。•体外药效学方法–利用体外细胞与活性蛋白质多肽的特异生物学反应，通过剂量（或浓度）效应曲线进行定量。是制定药物制剂质量标准最基本的方法。•体内药效学方法–将药物给予动物或人体后所反应出的药效学反应。4.3制剂中药物的体外释药速率的测定•蛋白质药物的体内外释药速率的测定方法–具体方法：将数个试验组的微球（每个试验组设置数个取样点）置于一定量的溶出介质中，放入37℃振动孵箱中，定时取样离心分离测定微球中药物含量。–影响释放的因素有：介质pH，离子强度，赋形剂，转速，温度等。影响药物释放行为的因素（以微球为例）•聚合物的影响•聚合物中药物释放的机制：扩散机制和降解机制–聚合物的组成对释放的影响–聚合物分子量对释放的影响–聚合物结构对释放的影响–聚合物与药物的相互作用对释放的影响药物对释放的影响•载药量对释放的影响–高载药量的微球突释及累积释放都显著高于低载药量微球。•药物稳定性对释放的影响–蛋白类药物极易在微球内部聚集称为不溶性沉淀而影响药物释放。制备工艺对释放的影响•复乳法制备工艺：制备初乳时蛋白质发生不可逆聚集，造成释放不完全。•部分无水法制备工艺•低温喷雾提取法制备工艺•喷雾干燥法制备工艺•附加剂对释放的影响4.4制剂的稳定性研究：物理稳定性和化学稳定性4.5体内药动学研究：对于非静脉给药的控缓释制剂的体内药动学试验可考虑选择放射标记法测定血浆中药物的量，该方法灵敏度高，适合多数蛋白质类药物体内血药浓度的测定。4.6刺激性及生物相容性研究：根据我国SFDA（StateFoodandDrugAdministration）药品注册管理办法规定，皮肤、粘膜及各类腔道用药需进行局部毒性和刺激性试验，各类注射（植入）途径给药剂型除进行局部毒性和刺激性试验外还需进行所用辅料的生物相容性研究，以确保所用辅料的安全性。参考文献•[1]姜忠义，高蓉，许松伟等.药物蛋白的聚乙二醇修饰.中国药学杂志,2002，3