HPV的检测及其临床应用

HPV的检测及其临床应用陕西省人民医院检验科刘文康HPV乳头瘤病毒科属小DNA病毒乳头瘤病毒的基因组主要编码三组基因三个癌基因，包括E5、E6和E7，负责调节癌细胞转化过程；两个调节基因，包括E1和E2，负责调节转录和病毒基因组的复制；两个结构蛋白基因，包括L1和L2，组成病毒颗粒HPV感染属于常见的性传播感染直接的皮肤-皮肤接触是传播的最有效途径病毒不通过血液或体液传播（例如精液）HPV感染生殖器HPV感染的潜伏期变化极大。一般来说，生殖器疣在HPV感染3-6月后显现，然而也有研究表明潜伏期有数个月甚至几十年；绝大多数的HPV感染是一过性的，新发感染大多1-2年内会发生自愈；仅有少数的HPV感染会保持潜伏性，几年或几十年后会再激活。多数生殖道HPV感染无临床症状与HPV相关的宫颈疾病包括：宫颈湿疣、宫颈病变和宫颈癌等从HPV感染到释放病毒约有3周。但是，HPV感染至出现损伤之间可能数周到数月。病毒感染的早期可能存在免疫逃逸，故没有炎症反应完整的HPV感染循环HPV感染颗粒突破下肛殖道表皮HPV感染颗粒进入表皮细胞的基底层随着基底层干细胞的子细胞分裂以及在垂直方向上的成熟化，病毒在基底层以上鳞状细胞中复制成熟的病毒在表面细胞分离时释放到环境中HPV分型最重要的分类学单元是型(type)与宫颈癌相关程度较为清楚的HPV型归为高危型HPV（16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73）和疑似高危型HPV（26,53,66）与尖锐湿疣等良性疾病相关的HPV被归入低危型HPV（6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81，89），一般认为这类HPV的感染不会诱导宫颈癌的发生HPV与宫颈癌的相关性年轻性活跃的女性HPV感染率最高，感染高峰年龄为18～28岁多属于一过性感染，通过自身免疫将HPV消灭只有持续感染HPV的妇女,才成为子宫颈癌高发人群HPV感染到发展成为子宫颈癌需要9-25年时间30%发展成为CIN1,10%发展成为CIN2,10%进一步发展成为CIN3，1%发展成为子宫颈癌宫颈癌前病变宫颈上皮细胞内瘤变（CIN）；包括宫颈非典型增生和宫颈原位癌，反映宫颈癌发生、发展的过程。从细胞学分为CINI、Ⅱ、III级，包含宫颈鳞状上皮细胞内病变和腺细胞内病变。宫颈癌现状女性第二大常见恶性肿瘤全世界每年新病例数为56.5万在发展中国家宫颈癌的发生率为发达国家6倍，有50%的病例发生在中国和印度中国每年新病例为18.15万中国每年有3万多的妇女死于宫颈癌发展中国家的新发病例多是晚期患者未能早期诊断细胞学检查未能普及阴道镜应用条件受到限制民众对宫颈癌的防范意识欠缺发病年龄原位癌的发病年龄为35-39岁浸润癌为40-49岁宫颈癌的新动向近年来由于生活方式的改变发病率:有上升趋势发病年龄:趋向年轻化HPV感染和宫颈癌在不同年龄组的发生率年龄(Years)HPV感染率(%)40-4415-1920-2425-2930-3435-3945-4950-54051015202530051015202530每10万人中宫颈癌发生率哪些些妇女更容易患宫颈癌性生活过早早孕多产或多次人工流产自己或性伴侣有多个性伴侣曾经或正患有生殖道HPV感染有或曾经患有其它性病吸烟、吸毒和营养不良内分泌紊乱或免疫力低下的妇女现在基本明确宫颈癌的病因就是高危型HPV的持续性感染。感染HPV病毒到发展成浸润癌需要大约十年的历程，这是重要不可忽视的时间，只要定期进行妇科健康检查，就可以及早发现子宫颈癌癌前病变并加以治疗，就可有效地扼制其癌变;预防子宫颈癌的发生。宫颈癌可以预防和治愈引起宫颈癌几个方面因素环境因素自身免疫因素HPV病毒持续感染宫颈癌变HPV致宫颈癌机理5--10yearsHPV感染持续HPV感染细胞分化异常CIN高度CIN3030宫颈癌辅助—致癌剂免疫因素HPVE6癌蛋白与宫颈恶性病变的关系HPVE7癌蛋白的分子生物学特性宫颈上皮细胞发生异常和瘤变的进化过程基底细胞膜正常轻度中度原位鳞状细胞癌变上皮变型HSIL细胞异型CIN1CIN2CIN3LSIL巴氏涂片活检HPV致宫颈癌进展示意图LSILLSILCISCA8—10年（100%治愈）2—5年（死亡）正常低度病变高度病变原位癌浸润癌关于HPV感染HPV感染多数不发展成为宫颈癌，可以在9-16(8-10)个月消失;间隔半年2次HPV（＋）;HPV持续感染;28%的持续感染者,在2年内发展为CINI；70%的持续感染者4年内发展为CINII;HPV实验室检测临床常用的HPV检测方法病理学检查细胞学检查免疫组化检测原位杂交技术检测聚合酶链反应(PCR)技术DNA芯片分型检测杂交捕获DNA分析病理学检查鳞状上皮疣状乳头状增生表皮角化不全棘层不规则增厚基底层增生上皮脚延长中表层出现灶状分布的挖空细胞等。细胞学检查凹空细胞、角化不良及湿疣外底层细胞细胞学诊断HPV感染敏感性较差免疫组化检测检测HPV的衣壳抗原来进一步明确HPV感染所得阳性反应定位明确,判断可靠必须在HPV-DNA复制成熟后才有衣壳装备敏感性较低原位分子杂交用来测定基因或特定核苷酸序列在核酸分子的所在部位，检测重组体DNA）通过非放射性探针对石蜡组织进行检测,能作定位检测,假阳性率低,但灵敏度不高,大大降低了临床使用价值。聚合酶链反应(PCR)技术设计与HPV-DNA互补的一对特异性核苷酸引物,以HPV-DNA为模板以指数增长的速率进行体外扩增敏感性最高,可对HPV进行分型,测定病毒载量,发现新基因型,对基因进行序列分析缺点为样品间易交叉污染导致假阳性杂交捕获DNA分析标本中的HPV-DNA与液相中的RNA探针结合,形成特异性的RNA-DNA杂交体,被微孔板内的特异抗体所捕获,然后被所加的发光底物检测,其发光的强度与标本中的DNA量成比例,因而可对HPV进行半定量检测效率高,适于大量人群检测,临床上操作简便DNA裂解→RNA-DNA杂交→抗体捕获→化学发光→计算机判读裂解加入探针杂交加入二抗和发光剂hC2方法，特异性强，准确率高，并能做到定量，但不能分出亚型。芯片技术，可在相同的条件下，分出亚型，但不能定量。因此，HPV亚型分类和定量检测研究将成为今后的重要课题。亚型和量化，可能对疾病的演变和转归提供更有利的证据。宫颈癌的筛查筛查对象21岁以上有性生活史或具有性生活三年以上的任何妇女。高危人群：有多个性伴侣、性生活过早、HIV/HPV感染、机体免疫功能低下、卫生条件差/性保健知识缺乏。某些情况无需进行筛查，如因良性疾病摘除子宫的妇女。起始年龄：在我国经济发达地区为25－30岁；经济欠发达地区为35－40岁。对于高危妇女人群，筛查起始年龄应适当提前。终止年龄：65岁后患子宫颈癌的危险性极低，故一般不主张对65岁以上的妇女进行子宫颈癌筛查。筛查间隔1、每年一次细胞学检查，连续2次（-），可3年一次2、连续2次HPV（-），细胞学检查（-）可5～8年一次3、高危人群：最好每年一次（CIN及以上、特殊职业、30岁以上高危HPV感染者）筛查方案根据《中国癌症预防与控制规划纲要（2004-2010）》推荐，一般可以选择下面两种筛查方案。醋酸或碘染色后肉眼观察（VIA/VILI）阳性阴性阴道镜+病理定期筛查（1次/年）相应治疗初级筛查方案流程图医生取材HPV检测+传统巴氏涂片（TBS分级）HPV（-）HPV（+）HPV（-）HPV（+）细胞学≤ASCUS细胞学≤ASCUS细胞学≥ASC-H细胞学≥ASC-H阴道镜检查/多点活检+ECC筛查（1次/3~5年）随访（1次/年）相应治疗一般筛查方案流程图取材HPV检测+液基细胞学检查（TBS分级）HPV（-）HPV（+）HPV（-）HPV（+）细胞学≤ASCUS细胞学≤ASCUS细胞学≥ASC-H细胞学≥ASC-H阴道镜检查/多点活检+ECC筛查随访（1次/3~5年）（1次/年）相应治疗最佳筛查方案流程图筛查建议筛查间隔：每年1次，连续2次细胞学筛查阴性，可延长至3年；若连续2次细胞学联合HC2HPV筛查均阴性，可延长至5-8年；免疫功能低下者筛查间隔应缩短。建议：每位妇女三年至少一次宫颈癌前筛查