生物芯片检测技术

生物芯片检测技术检测目的采用荧光、生物素或其它方法标记固定在生物芯片基片上的生物分子（如DNA、RNA、蛋白分子、抗原、抗体等）目标，并通过构建一些特殊的检测装置将标记信号转化成可供分析处理的图象数据，以便获得及分析在生物芯片上的生物分子的生物物理化学等各种信息，诊断生物分子的真实状态。将不可见的生物分子微弱变化通过生物、化学、光学、电子等多学科交叉技术的综合处理，转换成可见的数字图象信号，实现信号的放大、增强和可视化，以便进行研究、疾病诊断分析或其它应用。样品制备样品制备芯片设计芯片设计芯片制备芯片制备杂交反应杂交反应信号检测信号检测数据提取与分析数据提取与分析生物信息学分析生物信息学分析荧光标记检测表面等离子体共振化学发光检测电化学检测磷屏成像系统生物芯片的检测方法两大类型：物理检测方法、化学检测方法1.荧光扫描显微检测方法2.激光共焦扫描检测方法3.CCD(ChargeCoupledDevice)成像扫描检测方法4.化学发光检测方法5.电化学发光检测方法6.表面等离子体共振吸收检测方法8.磁光检测方法9.纳米技术生物芯片信号检测技术荧光检测化学发光检测表面等离子体共振检测纳米检测磁光检测光学信号电学信号质量信号电化学检测光电化学检测石英晶体微天平检测电信号检测优势仪器结构简单、成本低容易微型化，便于携带响应快速、灵敏功耗低、便于现场使用芯片与仪器连接方便电化学和光电化学检测技术激光共聚焦、CCD扫描技术液态芯片检测技术生物芯片的电化学、光电化学检测技术Xanthon公司的药物筛选系统Scribner公司的MMA多通道分析仪一、电化学检测系统电位型电导型电流型Ro-e+eMotorola公司的eSensor芯片问题：灵敏度（信噪比）不够高原因：电极－溶液界面电容充放电导致背景电流过大化学放大电化学检测光电化学检测SN电化学检测的原理电极上电子能量---外加电压决定分子中电子能量---分子结构决定化学放大电化学检测原理电信号产生：标记物（还原态）---标记物（氧化态）+e标记物再生：标记物（氧化态）+放大物（还愿态）---标记物（还原态）+放大物氧化产物背景电流：放大物（还原态）---氧化产物e电极溶液相标记物（氧化态）标记物(还原态）放大物(还原态）放大物(氧化态）特点:标记物分子多次参加电极反应，信号成倍放大；输入输出均为电信号化学放大电化学检测系统要求标记分子电极反应快、电位范围宽、易于制成薄层和图形化、材料便宜易得到，选择ITO导电玻璃。电极电化学标记物要求电极反应速度快、生物兼容性好、易衍生化、稳定性高，选择三联吡啶合钌（简记为Ru）。化学放大物要求背景电流低，水溶性好，在水中稳定，排除安全，选择草酸钠（10mM,pH5.5)。检测分析仪器包括信号发生器、数据采集系统、恒电位电路等单元。CHI630A单通道台式分析仪---便携式多通道分析仪生物检测模式AvidinBiotin-antibodyAntigenRu-antibodyITO电极系统设计常用电极工作电极材料：金，铂金，碳，ITO形貌：圆盘，薄膜，丝参比电极饱和甘汞银/氯化银辅助电极铂金片芯片设计玻璃衬底ITO薄膜绝缘层金属芯片加工第一类芯片加工第二类芯片加工玻璃基片上ITO光刻胶聚酰亚胺Au/Ti做好钝化层的芯片全貌（导线和焊盘为ITO）做好钝化层的芯片局部（导线和焊盘为Au/Ti）做好钝化层的芯片局部（导线和焊盘为ITO）ITO光刻后芯片全貌芯片化学放大电化学性能测试①②③同一电极在不同电解质溶液中的循环伏安曲线①草酸钠溶液;②含1mMRu(bpy)3的PBS缓冲液;③含1mMRu(bpy)3的草酸钠溶液Ep＝1.265Vip＝49.11nA1mMRu(bpy)3在PBS缓冲液中的循环伏安曲线1.12uA草酸钠对Ru的电化学反应有比较明显的放大作用光电化学检测原理特点:输入光，输出电;信号放大。优势:灵敏度高；成本低于光检测光电化学检测系统结构宽禁带半导体、与标记物能级匹配、表面积大、易于制成薄层和图形化、还原剂电流低。选择SnO2，TiO2。电极要求激发态寿命长、激发态能级与半导体能带匹配，易衍生化，稳定性高，分子不太大。选择Ru(bpy)3的衍生物。标记物要求背景电流低、水溶性好、在水中稳定、排除安全，能快速还原标记物氧化态。选择草酸钠（10mM,pH5.5）。电极波长为470nm的单色光源。光源光电流检测仪CHI800单通道电化学工作站CHI800电化学工作站500W氙灯及光学透镜组部分灯箱、镜筒及机械调节部分氙灯专用稳压电源垂直出射单色仪电屏蔽暗箱（内设电解池）光电化学电极的制备磁控溅射SnO2①空白SnO2电极和②直接吸附Ru染料的SnO2电极光电化学i-t曲线①②光电化学检测SnO2电极上的Biotin-avidin反应BSA光电化学电极的制备磁控溅射TiO2五种标记物在溅镀二氧化钛电极上的光电化学i-t曲线染料三有最大光电响应，但其值却比SnO2电极对应值小得多光电化学电极的制备磁控溅射TiO2空白TiO2电极Ru染料吸附的TiO2电极改变工艺条件和退火处理可以有效改善电极的光电响应光电化学电极的制备磁控溅射TiO2Avidin-Ru吸附的TiO2电极空白TiO2电极空白TiO2电极IgG-Ru吸附的TiO2电极Sol-gel法制备纳米晶膜扫描电镜照片商品化ITO玻璃（溅镀）ITO纳米晶膜生物芯片的激光共聚焦扫描技术激光共聚焦扫描仪的主要优点PMT(PhotoMultiplierTube)器件的分辨率比CCD器件要高；并且，根据共聚焦原理，PMT只能接收通过探测针孔的光，而来自生物芯片其他部位的杂散光因在探测针孔处不能成像而被滤除，结果得到的是一个高分辨力和高对比度的图像。PMT激光共聚焦扫描仪1）可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，无需清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤，大大提供了工作效率。2）根据共聚焦原理，PMT只能接收通过探测针孔的光，而来自生物芯片其他部位的杂散光因在探测针孔处不能成像而被滤除，结果可得到一个高分辨力和高对比度的图像。主要优点激光共聚焦扫描仪光路图绿光激光器生物芯片PMT红光激光器二向色镜窄带滤光片接收物镜激发物镜扫描运动平台针孔光路选择器激光共聚焦扫描仪硬件电路原理图USB通信模块CPLD运动控制模块信号采集、处理及PMT控制DSP（TMS320LF2407）最小系统信号处理及PMT控制单元A/D转换PMT滤波信号放大D/A转换DSP运动控制系统步进电机驱动器步进电机驱动器步进电机驱动器交流侍服驱动器二向色镜电机控制调焦电机控制X轴电机控制Y轴电机控制位置计数解码DSP使能急停异常控制激光共聚焦扫描仪信噪比/线性度测试01002003004005006001357911131517192123252729010000200003000040000500006000013579111315171921232527290500100015002000250030003500400045001234567891011121314151617181920背景噪声全程线性度弱信号线性度Scannerarray自制扫描仪Scannerarray自制扫描仪LuxScanvsScanArrayScanArrayExpressPMT80Power80LuxScanTM10KPMT80Power80分辨率测试LuxScan10K50um分辨率LuxScan10K20um分辨率LuxScan10K10um分辨率LuxScan10K5um分辨率CCD成像激光扫描检测系统1)以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无需扫描传动平台;2)由于不是逐点激发探测，激发光照射整个芯片区域;3)由CCD相机直接获得整个DNA芯片的杂交谱型.特点:CCD成像面扫描检测仪原理：CCD面扫描方式CCD芯片滤光片载物台滤光片会聚镜准直镜衰减器聚焦镜CCD成像扫描检测系统CCD快门滤光片分光镜目镜光纤准直透镜XY双向运动平台耦合透镜双激光诱导荧光检测系统CCD快门滤光片分光镜目镜光纤准直透镜XY双向运动平台耦合透镜信号放大A/D采样CPUD/A转换10M网线XY双向运动平台物镜光电倍增管针孔滤波器荧光会聚透镜滤波片激光器635nm光纤耦合透镜准直透镜快门滤光片衰减器分光镜2CCD成像激光扫描激光共焦扫描CCD成像激光扫描检测双激光诱导荧光检测系统工作原理配有四台激光器用来诱导相应的波段的染料激发荧光。系统采用纤维光路，样片放在显微镜物镜的物面上，激发DNA样品产生荧光，经过滤波后汇聚到CCD的光敏探测平面（显微镜物镜的像面上），然后被放大输入计算机，实现样品的荧光探测。光源：2路He激光，红光632.8nm，功率10mw2路Nd:YAG激光，绿光532nm，功率10mw多种染料：Cy3，Alexa532，Cy5，BODIPY探测灵敏度：10荧光分子/微米2探测范围：直径几十微米－几毫米系统组成包括：扫描仪硬件设备、扫描仪控制处理单元、图像采集卡、通用PC机和软件系统CCD检测系统构架液态芯片技术（xMAP技术）FlexibleMulti-AnalyteProfiling多组分分析液相芯片技术液相芯片技术是二十一世纪初诞生的后基因组时代产品的杰出代表，液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台，这个技术平台整合了生物检测，乳胶微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。液相芯片的核心技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）。应用时，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入微量待检测或分析标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合。结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。液相芯片技术平台应用面非常广泛:因为乳胶微球上即可以包被蛋白又可以加上核酸，所以液相芯片可以用来诊断蛋白变化（免疫反应或酶反应）也可以诊断核酸变化（DNA或mRNA）。液相芯片技术平台具有高效性：因为上百种颜色的乳胶微球可以方在同一个反应体系内，所以一小份标本（血，或其它体液，组织）可以被用来同时检测上百个生理或病理指标。液相芯片技术平台具有高敏感性：每个乳胶微球上都可以满满地（以共价键牢固结合的方式）包被上抗原、抗体、或核酸。因为探针密度高，产生的信号强，加上使用荧光检测，所以敏感性大大高于任何现有分析、诊断方法，也高于其它芯片法。液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台,这个技术平台整合了生物检测，乳胶微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。液相芯片技术的特点1、多功能性。xMAP技术不仅能够检测核酸（DNA和RNA），还能够检测蛋白（抗体和抗原，受体和配体）。多任务性的能力使xMAP技术特别适合在各种水平做鉴别诊断。2、高敏感性。每一个微球体偶联了成千上万的探针，因而它能捕获更多的扩增的病原靶产物。它最少能够检测到0.2μL的PCR产物，而采用常规的典型胶分析的方法需要超过10μl的PCR产物。所以xMAP方法的检测灵敏度可以比凝胶电泳法高50倍。3、特异性。两束激光分别分析杂交信号（敏感性）和乳胶微球上荧光颜色（特异性），而且激光只分析微球一定半径内的信息，所以检测特异性强，背景低。4、高通量。微量（10μl）标本,1次能够检测多达100个不同的分析物。5、小样本。只需要很少量的样本：如一般只需要几滴血就足够进行蛋白和核酸分析，对别的样本的需要量也很小。液芯联检试剂用量少。6、快速。一个采用xMAP技术的典型检测反应不超过15分钟。最快可达10000测试/小时7、准确。对于每一个待分析检测靶点，为了作统计学评估，系统读100个相同的颜色编码的微球体。液相芯片技术