DNA的复制

第三章DNA的复制第一节半保留复制的验证半保留模型（semiconservativemodel）全保留复制模型(conservativemodel)分散模型(Dispersivemodel)。半保留复全保留复分散模型制模型制模型15N15N15N15N15N15N第一次复制14N15N15N14N15N15N14N14N14N14N15N15N15N15N14N14N第二次复制图11-1三种不同的复制模型验证半保留复制的实验一、Meselson-Stahl实验二、Taylar实验15N15N14N14N/15N15NDNA浓度14N14N/15N15N离心第14N一14N15N14N15N次离心实验14N15N14N14N14N14N14N15N离心第离心二次实验14N15N离心密度(a)(b)(c)图11-2Meselson-Stahl实验(a)实验结果的解释(b)SsCl梯度离心的结果；(c)离心后DNA的吸受率图11-4Taylor蚕豆根尖放射自显影实验。(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。(a)2H3H2H2H(b)2H3H2H2H第二节复制原点、方向和方式一.复制原点1.定义DNA分子上复制开始的特定位置叫复制原点。常用ori或o表示。E.Coli的复制原点位于ilv基因附近，是约245bp的一段序列。2.特点富含A•T，与SSB结合。3.原核生物（一个）和真核生物（多个）DNA的复制无一例外的都是从复制原点开始。二.复制方向1.双向等速复制E.coli,真核生物的染色体复制。2.双向不等速复制枯草杆菌等。3.单向复制质粒ColE1等。Orit/Orit(a)(b)图11－8(a)若有固定起始点，双向负制，则复制终点应在起点的对面。(b)若有固定起始点,单向复制，则复制终点应和起点重叠。图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同复制起点标记的拷贝数应最多1234123121三.复制方式1.眼型线状双链DNA的复制:单眼或多眼。2.θ型环状DNA分子双链单向、双向复制均可形成。如E.Coli的复制。3.滚环型（σ型）双链环状DNA分子单向复制的一种特殊形式。DNA复制开始于复制原点处单链的切割，单链5΄端被单链DNA结合蛋白覆盖，而3΄-OH端在DNA聚合酶的作用下以未切断的一条环形链为模板不断延伸。整体上DNA的复制是5΄端不断地甩出3΄端不断地延长，好象中间的一个环在不断地滚动一样，因而叫滚环复制。其形状象希腊字母σ，因此又叫σ复制。连环分子：在σ型复制中，被甩出的链到达一定的长度后也开始复制最终可得到一种是原来DNA分子若干倍的中间产物，这样的一个分子就叫连环分子4.D环复制环状双链DNA分子进行单向复制的特殊方式。发现于动物线粒体DNA的复制。双链环在复制原点解开，进行单向复制。两条链合成高度不对称，一条链上迅速合成其互补链，另一条则为游离的单链环（即D-环）。第三节原核生物复制的酶学一.DNA合成酶DNA聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH；（3）合成的方向都是5‘→3’（4）除聚合DNA外还有其它功能。表11-1E.coli中的三种DNA多聚酶DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ结构分子量109KD90KD900KD构成单体单体异多聚体分子数/细胞400？10-20酶活性：5→3`聚合酶+++3`→5`外切酶+++5`→3`外切酶+－－(可切单链)突变体突变位点polApolBpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制(一).DNA聚合酶I的结构DNA聚合酶有6个结合位点：(1)模板结合位点；(2)引物结合位点；(3)引物3‘－OH结合位点；(4)底物dNTP结合位点；(5)5‘→3’外切酶位点；(6)3'→5'校正位点。(二).DNA聚合酶Ⅰ的功能1.5‘→3’聚合功能2.3‘→5’外切活性3.5‘→3’外切活性（游离的5端；配对）(1)切刻平移（nicktranslation）；(2)链的置换；(3)模板转辙（template-switching）4.内切酶活性5.填充缺口聚合3'－5'外切5'－3'外切3'5'dNTPNMP5'3'图11-19DNA聚合酶Ⅰ的结构和功能5'3'GTAAGTCG·····CTCAGC5'3'3'－5'外切核酸酶水解部位图11-20DNA聚合酶Ⅰ的3'－5'外切酶活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-16)3'5'GGACAAGA·····GACGTTCT5'3'内切酸酶水解部位图11-22DNA聚合酶Ⅰ的内切酸活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-20)5'3'-OH5'-P3'5'3'3'5'缺口平移链的置换模板转换5'3'5'5'3'5'3'3'5'3'5'3'5'(a)(b)(c)图12-21DNA聚合酶Ⅰ5'－3'外切活性的功能(三).DNA聚合酶II1.结构分子量为90KDa，由polB基因编码。2.功能3‘→5’外切活性5‘→3’聚合酶活性(四)DNA多聚酶Ⅲ的结构PolⅢ*核心酶α：130K(polC即dnaE)—DNA合成(470K)(165K)ε：25K(dnaθ)—3'－5'外切酶活性,校对2核心＋2τ合成DNAθ：10K—使核心酶相互连接。PolⅢ'增加进行性(750K)τ：71K(dnaZX)—使核心酶形成二聚体，与模板连接。具有全酶使γδ复ATP活性。合成前合体结合导链和模板δ：32KEFⅢ,催化β亚基转移到模板链上。EFⅡ后滞链γδ复合体γ：52K(dnaZX)催化β亚基转移到模板链上。(附加亚基)δ'：35Kχ：15Kψ：12Kβ：40K(dnaN)—识别模板链，将酶“夹”到DNA链上。图11-23DNA聚合酶Ⅲ的成分与功能功能：1.5‘→3’聚合功能2.3‘→5’外切活性3.5‘→3’外切活性（游离的5端；单链DNA）无：(1)切刻平移（nicktranslation）；(2)链的置换；(3)模板转辙（template-switching）4.填充缺口二.DNA连接酶其作用机制是分三步进行：1、E＋ATP→E－AMP＋ppi在E.coli中，E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸）2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5‘-PO4上使其活化3、活化的5‘－PO4与相邻的3’－OH作用形成3‘－5’磷酸二酯键，并释放出AMP。可以链接单链吗？三.单链结合蛋白又称为双螺旋去稳定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177个aa组成在E.coli中以四聚体存在分子量为74kD（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。四.解旋酶(helicase)表11-3E.coli及噬菌体的解旋酶解旋酶结构功能DnaB330K六聚体结合与OriC,Oriλ参与前引发分离双链，水解ATP,提供能量。rep蛋白66K单体ATP依赖性解旋酶，在φX174滚环复制中推进复制叉PriA(w蛋白)82K单体φX174Rf形成中参与前引发体3’→5′移动取代SSB，识别特异位点。TraY/I多聚体F因子滚环复制中解链。基因4蛋白58KT7噬菌体复制中延5’→3′解链。五.旋转酶α2β2组成，产生负超螺旋来消除DNA复制中由于双链的解开产生的正超螺旋。第四节DNA复制的半不连续性一.半不连续复制的概念二.特点两条子代链的生成方向都是从5΄→3΄；两条子代链一条是连续的（母版3΄→5΄），一条是不连续的（母板是5΄→3΄）；两条子代链合成的速度大体相同；连续合成的链总是领先于不连续合成的链，因此前者称为先导链；后者称为后随链;DNA聚合酶（PolIII）实现了先导链和后随链的同时复制。三.相关概念引物：1-10个核苷酸组成的RNA,需要1或多条；引发酶：合成RNA引物的酶。E.colidnaG编码；引发体：无或低活性的引发酶与有关蛋白质结合形成的一个有活性的复合体；转录激活：RNA聚合酶通过转录作用解开局部的DNA双螺旋，进而引发体结合到解开的单链的特定序列上，合成引物，启动DNA的复制，该过程被称为转录激活。RNA聚合酶作用：产物直接充当引物、解开双链，供引发体结合合成引物。四.冈崎片断的连接带有引物的冈崎片断之间存在缺刻或切口；PolI发挥5’-3’核酸外切酶活性切除RNA引物（RNAaseH参与），同时发挥5’-3’聚合酶活性进行切刻平移或缺口填充；DNA连接酶连接切刻两边的相邻核苷酸，产生一条完整的DNA分子。五.复制叉处发生的反应（1）PolIII全酶在两条新生链上进行的聚合反应；（2）DNA引发体和成引物RNA；（3）PolI和DNAaseH切除引物并填充缺口；（4）DNA连接酶将一个个冈崎片断连接到后随链上；（5）DNA螺旋酶解开双链；（6）ssb蛋白结合到解开的单链上；（7）DNA解旋酶产生负超螺旋消除复制叉前进所产生的正超螺旋。六.E.coli复制机构的复杂性dnaA：复制起始，作用于oriC；dnaB：引发体组分，6聚体，具有螺旋酶活性；dnaC：引发体组分，6个单体分别结合在6个dnaB六聚体上；dnaE：PolIII的核心蛋白，具有聚合、校对的功能；dnaG：引发酶，合成引物，单体；dnaN：PolIII全酶的β亚基，“夹子”；dnaQ：较高的保真度，PolIII的ε亚基；gyrA/B：DNA旋转酶αβ亚基，引入负超螺旋，消除正超螺旋；rep：螺旋酶，解链；ssb：单链结合蛋白，4聚体，防止链间和链内氢键形成；i,n,n’,n’’：引发体及预引发体组分（引物合成有关）。第五节DNA复制的起始前导链和后随链合成的起始。一、前导链合成的起始1、从新起始在复制原点外，RNA聚合酶进行转录激活，解开双链，引发体结合上去，合成一段RNA引物，从而起始DNA复制。（1）复制原点与复制起始所有基因组DNA的复制都是从原点开始；DNA复制时，在复制原点外先形成一个复制泡：先导链一经引发并开始合成，与模板形成双链结构；另一亲本链被置换出来，形成三元泡状结构，又叫置换loop/D-loop；先导链继续延伸，另一条链的特殊序列被置换出来，预引发体形成（i,n’’,n’,DnaB），引发体形成（引发酶结合），合成引物，开始复制。（2）OriC与E.coliDNA复制的起始①oriC的结构特征oriC是E.coli的复制原点，245bp，与复制的起始、终止和染色体在子代细胞之间的分配有关。其结构特征如下：a、（A+T）含量占56%，相对较低；b、除碱基序列高度保守外，某些部分碱基的数目十分保守。+92，+155，+244位点允许突变，不允许插入和缺失碱基；c、在oriC中，含有9-14个GATC位点（E.coli为11个）。其中A的甲基化是复制所必需的；d、有4个高度保守的DnaA识别位点：R1、R2、R3、R4。其中R3是R1的正向重复序列，R2是R4的正向重复序列，而R1与R4是互为完全的反向重复序列；e、在oriC中，没有大于20个密码子的开放阅读框。复制起点具有3个13bp和4个9bp的重复顺序GATCTNTTNTTTTTTATNCANADnaA单体结合在9bp的重复顺序上13bp9bp20～40个DnaA单体形成一个大的复合物在13bp重复顺序上DNA解链DnaB/DnaC结合成复合体，产生了复制叉DnaBDnaBDnaC图11-28前引发涉及到系列蛋白的连续装配并导致DNA的解链(引自B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997，Fig15.18)②E.coliDNA复制的起始a.转录激活RNA聚合酶结合于16KDa基因的启动子P1和asnC基因的启动子P2，解开双链，发动转录，并终止于oriC（