第二章基因工程制药part2

高效表达目标基因的战略和技术表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性高密度发酵和工程化宿主细胞表达质粒的优化和设计在各种表达载体中，启动子和SD序列的下游都设计了一段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的一部分，因此它对构建高效表达质粒是至关重要的。由于每一个基因都具备各自独特的5‘端结构，最终构建成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。表达质粒的优化和设计表达质粒的优化和设计构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围。核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有显著影响，表达质粒的优化和设计具体表现为：SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3~6倍。翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6~8个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5~7个碱基长度。ATG与UAAGGAGG至少相隔3~4个碱基，与AAGAA至少相隔5个碱基mRNA的翻译才能进行。ATG与SD序列之间的碱基组成为A、T碱基丰富时，mRNA翻译效率较高。表达质粒的优化和设计核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因mRNA5’端的二级结构，研究表明mRNA5‘端形成的“茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱基的含量，降低mRNA5’端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。表达质粒的优化和设计在必要的情况下，还可通过顶点突变，PCR等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA5‘端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下。表达质粒的优化和设计在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻译增强子。表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有：编码Arg的密码子AGA、AGG、CGA、CGG编码Pro的密码子CCC、CCU、CCA编码Cys的密码子UGU、UGC编码Gly的密码子GGA、GGG编码Leu的密码子CUA、CUC编码IIe的密码子AUA编码Ser的密码子UCA、AUG、UCG、UCC编码Thr的密码子ACA由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系，稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。解决这一问题的办法：通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率的同义密码子。在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因在所有的大肠杆菌稀有密码子tRNA中，tRNAArg（AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密码子在真核基因中经常出现。人尿激酶原ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂NTA等基因中都含有较多的AGG和AGA密码子，在大肠杆菌中直接表达的水平很低，但在大肠杆菌中共表达tRNAArg（AGG/AGA）基因argU后，这些基因的表达水平能明显得到提高。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因现在还没有一个固定规则来判定稀有密码子的存在是否确实会对翻译过程产生明显的不利影响。因为稀有密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA的二级结构的不同决定了它对翻译是有差别的。所有的结论要通过实验才能得出。由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白质水解酶能够降解目标基因mRNA和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因蛋白质水解酶的特点细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋白质的统计学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp残基的蛋白质，含有Pro、Glu、Ser、Thr丰富区的蛋白质降解，稳定性较差。在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白质水解酶活力往往能达到比较高的水平。共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因1.利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间，或分泌到培养基2.采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。3.对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达。4.共表达能提高特定目标稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因。5.对蛋白质序列中的蛋白质水解酶敏感区域和识别位点进行改造。6.在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。提高目标蛋白的稳定性的措施但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要表现为：•大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率一般比较低，不能满足大规模制备的需要。•蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速度慢，使高密度发酵比较困难。•融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致生物比活力降低，甚至没有活性。•融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学切割出单体目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。•对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数据，而目前这方面的数据库还不完整。大肠杆菌高密度发酵时大规模制备蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种。高密度发酵和工程化宿主细胞构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的积累，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的抑制作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要解决的问题。虽然在发酵过程中可采取通氧气，提高搅拌速度，控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度，减少乙酸的产生。但从实际应用上看，这些措施都有一定的滞后效应，难以做到比较精确的控制。因此构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从根本上解决问题的途径之一。高密度发酵和工程化宿主细胞利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因vgb导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值。用基因敲出技术缺失大肠杆菌的磷酸乙酰酶基因pta1和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合途径被阻断。改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶基因adh2导入大肠杆菌，使丙酮酸代谢有选择地向生成3‘-羟基丁酮或乙醇的方向进行。高密度发酵和工程化宿主细胞构建蛋白质水解酶活力低的工程化宿主菌对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言，随后发酵后期各种蛋白酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。为了使对蛋白酶比较敏感的目标蛋白也能获得较高水平的表达，需要构建蛋白水解酶活性低的工程化宿主菌。rpoH基因编码大肠杆菌RNA聚合酶的r32亚基，r32亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH基因缺陷的突变株已经被构建，研究结果表明它能明显提高目标基因的表达水平。到目前为止，已知的大肠杆菌蛋白水解酶基因缺陷的突变株都已被获得，其中一部分具有实际应用的潜力。高密度发酵和工程化宿主细胞大肠杆菌表达系统研究的发展趋势构建各种表达载体建立新的表达系统目前研究的重点完善现有的表达系统，解决表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括：•重组蛋白质的正确折叠、构象形成和分泌•菌体表面表达技术及其应用•重组蛋白质修饰加工研究大肠杆菌表达系统研究的发展趋势共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中，大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白质因子的量不能满足需要，无法形成正确的构象而产生的，因此在大肠杆菌内共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣，折叠酶或硫氧化蛋白基因可以使目标基因可溶性表达的比例明显上升。研究表明这种作用是具有专一性的，不同的目标蛋白需要不同类型的蛋白因子共表达。在有些情况下需要多个蛋白因子共表达才能达到预期的目标。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势共表达人或小鼠的二硫键异构酶、促进二硫键形成和正确折叠大肠杆菌周质空间通过二硫键形成酶DsbA和DsbB二个蛋白维持适当的氧化还原态势使蛋白质的二硫键形成。共表达人或小鼠的蛋白质二硫键异构酶（PDI）PDI能互补dsbA缺陷株，但在dsbB缺陷株中PDI失去原有的功能PDI对目标蛋白的二硫键形成和正确折叠的促进作用可以受到谷胱甘肽的调节。PDI具有的二硫键异构，交换和功能有效地弥补了DsbA和DsbB功能上的不足，从而提高了目标蛋白正确折叠的比例。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势降低蛋白质合成的速率，从而增加正确折叠重组蛋白质从phoA基因合成速度低的突变株中发现其分泌在周质空间的phoA的产物-----碱性磷酸酯酶比野生型菌株有显著增加，由于只有构象正确的酶原才能被大肠杆菌蛋白转运系统识别和分泌，这一结果表明了目标蛋白合成的速率能对其构象形成正确与否产生影响。采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降低蛋白质合成的速率，从而达到增加正确折叠重组蛋白质的目的。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因phoA信号肽的疏水区置换为多聚Leu残基能明显提高分泌效率。表明信号肽核心部位疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好参考依据。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势大肠杆菌表面表达技术的建立膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点领域，膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面技术的建立。外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程度上能与噬菌体展示系统相媲美。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势大肠杆菌表面表达技术的建立主要通过三条途径是目标蛋白呈现在菌体表面：把外源序列插入LamB、OmpA、PhoE等外膜蛋白的膜外区把外源蛋白导入大肠杆菌鞭毛或伞毛的结构这二种方法适合表达一段长度小于100个氨基酸残基的外源序列，因为较大的外源序列的插入往往会使外膜蛋白不能形成原来的三维结构，影响它转运过程和在膜上的定位。在脂蛋白、lgA蛋白酶、ompA基因的N端或C端融合外源基因这种融合表达的方法对外源基因的限制条件就比较小，其序列可在50到500氨基酸残基长度范围内。大肠杆菌表达系统研究的发展趋势重组蛋白质修饰加工研究蛋白质C末端酰胺化和侧链糖基化是常见的翻译后修饰加工类型，目前C末端酰胺化一般都是在体外通过肽酰苷氨酸酰胺酶把C末端甘氨酸转换为氨基把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺酶，真核生物糖基化过程所涉及的酶系导入大肠杆菌的设想很早就被提出，但这些工作都还在探索之中。其中需要研究的主要问题有：如何使肽酰苷氨酸酰氨酶在大肠杆菌内有较高的活力和专一性；如何通过基因工程技术改造真核生物的糖基化体系使其能整合到大肠杆菌的染色体中和对糖基化位置、糖基种类和长度进行控制。重组工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善基因工程菌不稳定性的策略四、基因工程菌的稳定性重组工程菌的遗传不稳定性的表现基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下