硕士论文-丙烯酰胺修饰核酸凝胶固定芯片制备及在SNP、甲基化

东南大学硕士学位论文丙烯酰胺修饰核酸凝胶固定芯片制备及在SNP、甲基化检测中的应用姓名：万源申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：陆祖宏20061101丙烯酰胺修饰核酸凝胶固定芯片制备及在SNP、甲基化检测中的应用作者：万源学位授予单位：东南大学相似文献(10条)1.学位论文孙蓓丽基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量SNP检测芯片的研究及应用2006随着人类基因组序列的绘制完成，生命科学领域的研究热点正迅速转向对基因功能、表达调控、多个基因间以及基因和环境间相互作用等方面。对基因组序列中单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)的研究是该阶段的重要研究内容之一。SNP作为第三代遗传标记，具有数量多、密度大、分布广等特点，可用于疾病基因的定位与克隆、关联分析等，并在疾病的早期诊断、预防和治疗等方面体现重要功能和应用价值。SNP的分型检测技术种类繁多，各有利弊，探索和建立准确、快速、高通量的SNP检测方法仍然十分必要。DNA微阵列由于其平行性、高通量检测等特点，在SNP分型上有很火的优势。基于DNA微阵列的SNP分型技术有两种：一是将寡聚核苷酸固定在基片上检测靶DNA中多个SNP位点：一是将靶DNA固定在基片上检测大量样本的某些特定位点。本论文在对第二种SNP检测技术进行优化的基础上，提出了一种新型的基于三维凝胶载体的DNA微阵列检测SNP的分型技术，并将其应用于冠心病易感基因的研究中，主要内容如下：1.基于二维DNA微阵列的SNP检测技术的优化比较氨基、醛基、多聚赖氨酸三种不同玻片修饰方法，以及不同PCR产物长度的固定、杂交效率，结果表明，采用醛基修饰的玻片上固定200bp左右的PCR产物，具有较高的固定、杂交效率和信噪比。但这种二维DNA微阵列对PCR产物的需求量大，固一液相反应效率较低，用于高通量SNP检测还存在灵敏度、重复性、稳定性等多方面的不足。2．基于三维凝胶的SNP检测芯片的制备与优化与传统的二维核酸微阵列相比，凝胶DNA微阵列特有的三维网状结构可以固定更多的核酸分子，水凝胶载体提供类似于液相的反应环境，可以作为良好的核酸同定载体进行SNP检测。我们采朋将丙烯酰胺修饰的PCR产物与丙烯酰胺单体等混合，点样丁玻片上，在充满TEMED的真空干燥器内聚合成聚丙烯酰胺凝胶，制备三维凝胶的[)NA微阵列。与分别标记Cy3、Cy5的荧光探针杂交，通过电泳清除非特异性键合，可有效识别单碱基错配。通过进一步对聚丙烯酰胺凝胶浓度、产物变性方法、探针长度、电泳条件等进行了一系列优化，以及通用标签探针的应川，建立了一种新型的基于三维凝胶DNA微阵列的SNP检测技术，具有比二维芯片更理想的准确性、灵敏度、稳定性和重复性，并极大地降低了SNP检测成本。3．基于凝胶的SNP检测技术应用于冠心病易感基因的研究利用生物信息学筛选功能性SNPs，并应用于冠心病研究中。我们初步筛选出了OLRl、MMP-1、MMP-13、MMP-11、MMP-27和MMP-L1等6个基因的7个SNPs位点用于冠心病易感基因的研究。基于三维聚丙烯酰胺凝胶DNA微阵列技术，我们对238例冠心病患者和233例正常对照进行SNPs分型检测，并采用case-control方法进行统计和遗传学分析。结果显示：将病人组按照生化指标是否异常分组，在HDL1.55mmol/L和HDL≥1.55mmol/L的女性冠心病人组间、LDL≥3.12mmol/L与LDL3.12mmol/Ld的全部及男性冠心病人组间，OLRl基因上5’UTR位置的SNP(rs1050283)的基因型分布具有显著性差异(p值分别为0.045、0.036和0.027)，表明OLRl基因与冠心病具有一定的相关性。同时我们的实验结果也进一步表明基于凝胶的SNP检测技术具有灵敏度高、成本低、准确性、稳定性和重复性好等特点，在临床检测中具有极大的应用前景。2.学位论文潘志强三维凝胶DNA芯片热聚合制备及其应用研究2008基因芯片技术已成为近年来的研究热点，其高通量的平行性分析的特点受到了越来越多的关注。同二维凝胶芯片相比，三维聚丙烯酰胺凝胶芯片具有固定DNA能力高的特点，它已被应用于众多的研究领域。但是，目前制备聚丙烯酰胺凝胶芯片的方法仍然存在较多缺点，如制备速度慢、芯片易污染以及信噪比较低等。本研究发展了一种制备聚丙烯酰胺凝胶芯片的新方法，提高了凝胶芯片的信噪比，建立了基于凝胶芯片的SNP检测平台。此外，还成功地发展了一种用于焦测序的单链DNA模板凝胶制备技术，初步建立了芯片固相焦测序平台。1.热介导法制备聚丙烯酰胺凝胶芯片。发展了凝胶芯片的热聚合制备法。将不会凝集的预聚物(包含PCR产物，1.4％过硫酸铵，6％丙烯酰胺，20％甘油和平衡水)点样到芯片上，通过直接对预聚物芯片80℃加热2min，可以实现三维凝胶芯片的快速制备。本研究优化了PCR产物凝胶芯片的制备条件，提高了DNA的固定效率和芯片制备的质量，研究了凝胶芯片上进行单碱基或多碱基错配检测的条件。实验研究结果表明：与现有凝胶芯片制备方法相比，该方法具有制备简单、快速、无需激发剂四甲基乙二胺等优点。此外，PCR产物可以直接被用于凝胶芯片制备中，从而节省大量PCR产物纯化的时间和避免PCR产物可能的污染。2.三维凝胶芯片在SNP分型上的应用。应用热聚凝胶芯片，研究了γ-氨基丁酸A受体的β2基因(GABRB2)两个单核苷酸多态性(SNP)位点(包括194072A/G位点和252944C/G位点)的基因分型。首先，运用等位基因特异探针杂交法对凝胶芯片上54个靶标DNA进行了SNP分型检测。实验结果表明：热聚法凝胶芯片能够准确地对试验样本进行检测，试验结果获得了进一步测序验证。还发展了热聚凝胶芯片等位基因特异延伸技术，进行SNP基因分型方法研究。但是，该方法中仍有一些引物-模板间的碱基错配如G：T、C：A等容易发生错配延伸现象，这样容易造成了SNP检测信号的假阳性问题。为解决这个问题，三磷酸腺苷双磷酸降解酶(apyrase)介导的等位基因特异延伸反应被应用于SNP基因分型的检测。借助该降解酶能够有效阻止或减慢错配的引物-模板之间的延伸反应，提高了延伸法检测SNP分型的特异性，实现了对多样本的GABRB2基因194072A/G位点SNP的正确分型。该研究进一步提高了热聚凝胶芯片利用延伸法进行SNP分型的准确性，为热聚凝胶芯片的SNP分型应用奠定了坚实的基础。热聚凝胶芯片还具有较高的应用潜力和拓展空间，如突变研究、甲基化检测以及凝胶固相PCR等。3.低频超声提高凝胶芯片信噪比。对于三维凝胶芯片来说，聚丙烯酰胺凝胶是一种具有多孔结构的DNA支持介质。虽然该结构提高了DNA固定能力，但是由于多孔结构对杂交荧光探针具有强烈吸附作用，又会造成了凝胶芯片较高的背景噪音。本研究采用了低频超声快速清除非键合探针的技术，很好地降低了凝胶芯片背景，提高了凝胶芯片的信噪比。实验中对超声条件和杂交探针特性进行了研究，发现适合超声法处理凝胶芯片的报告探针适合长度为13碱基，超声的较好条件是15℃处理35sec。上述条件下，凝胶芯片的信噪比能获得了很大提高。最后，应用该技术对具有114个样本的凝胶芯片进行了处理。实验结果表明，低频超声的方法能够有效提高凝胶芯片的信噪比，满足多样本凝胶芯片进行基因分型高灵敏度的要求。该技术为三维凝胶芯片提高信噪比提供了一种高效、快速的新方法。4.三维凝胶芯片在焦测序中的应用。焦测序是一种新的重要的测序方法。高质量低成本的测序模板制备是获得准确测序信号的保证。目前制备焦测序单链DNA模板的方法有酶消化法和磁珠或琼脂糖珠子法。酶消化法需要对PCR产物中的所有干扰因素，如过剩扩增引物、dNTP和焦磷酸等进行完全消化以消除对测序信号的干扰，该方法成本较高且很难获得理想的单链DNA测序模板。磁珠或琼脂糖珠子法虽然能够获得的模板量较大，但成本仍高且需要特殊的装置。为此，本研究借助热聚凝胶法为焦测序制备了凝胶固定的DNA测序模板。试验过程中，将PCR产物直接混合到凝胶预聚物中，通过对其加热聚合后，再将凝胶固定的双链DNA变性，即可得到焦测序单链DNA模板。试验结果表明液相焦测序中能够获得高质量的测序信号。利用该方法制备的DNA模板，GABRB2基因194072A/G的SNP位点的样本被准确进行了测定。该技术提供了一种低成本焦测序模板制备方法。另外，本研究还发展了一种凝胶芯片固相焦测序方法，即将固定有DNA凝胶点在光纤芯片上制备成多阵列，然后通过在芯片上进行的焦测序反应实现对芯片上待测DNA序列的测定。目前已应用该方法对2×2阵列上多个碱基序列进行了准确测定。3.期刊论文黄曙海微阵列技术(基因芯片)在毒理学研究中的应用-广西医学2004,26(6)1概述微阵列技术(MicroarrayTechnologies)属于生物芯片的范畴.生物芯片是20世纪90年代中期发展起来的一项尖端技术,该技术采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子如cDNA、蛋白、多肽、组织、细胞等生物样品有序地固化在玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体的表面,组成密集的二维分子阵列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机对杂交信号的强度进行快速分析,通过检测杂交信号的强弱来判断样品中靶分子的数量.由于常用玻片/硅片作为固相支持物,且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以又称之为生物芯片技术.4.学位论文蒋志云泌尿生殖道感染主要病原体检测基因芯片的构建及临床初步应用2008目的:80年代以来，性传播疾病(STD)发病率日趋上升，其中淋菌性尿道炎和非淋菌性尿道炎(NGU)发病率较高，前者由淋病奈瑟菌(Ng)感染引起，而后者主要由解脲脲原体(Uu)、人型支原体(Mh)等感染引起。由于引起泌尿生殖道感染的病原体复杂、多样，为临床治疗带来困难，因此迫切需要寻求一种特异性强、敏感性高同时又快速、经济的病原学检测方法，为临床病原学治疗提供实验依据。目前临床用于泌尿生殖道感染病原体检测的方法有培养技术、免疫技术和PCR技术等。这些技术在临床诊断中已发挥了巨大的作用，但仍存在一些缺点。培养技术繁琐而费时；免疫技术要有特异的抗血清。PCR技术本身的优越性是无可厚非的，但是使用不当很容易引起交叉污染，出现假阳性；如果反应条件控制不好也可能出现假阴性。这些缺点需要应用新的技术去弥补。近几年发展起来的基因芯片技术为泌尿生殖道感染的病原学诊断提供了一种强有力的手段。其快速、高效、高通量、并行化的检测特点在病原学诊断方面具有独特的优势。基因芯片技术在病原学诊断上的应用研究虽已取得很大进展，但目前尚无成熟的泌尿生殖道感染病原体检测基因芯片应用于临床，且我国学者在这方面的研究开展较少。本实验制备了一种可同时检测Ng、Uu和Mh三种病原体的复合基因芯片，以期为临床提供一种高通量、并行化的泌尿生殖道感染病原体的检测方法，并为我国日趋严峻的STD防治工作的改善奠定理论和实验基础。实验材料和方法:一、实验材料标准菌株淋病奈瑟菌ATCC29106，购于中国药品生物制品检定所；解脲脲原体ATCC33697，人型支原体ATCC23114均购于首都儿科研究所。临床标本来自中国医科大学第一附属医院皮肤性病科门诊就诊患者。支原体基础培养基PPLO购于北京泽平生物技术研究所，淋球菌琼脂基础培养基购于中国药品生物制品检定所，Uu和Mh的选择性鉴定固体培养基(二合一培养基)由上海恩康生物科技有限公司友情提供。PCR试剂盒(TaKaRa)引物与探针(上海生工合成)PCR扩增仪，生物芯片点样仪，激光共聚焦扫描仪。二、实验方法1、用液体和固体两种培养基培养Uu和Mh两种支原体标准菌株，用固体平板培养基在烛缸内培养Ng标准菌株。2、临床标本采集：用无菌棉拭子取男性尿道女性宫颈分泌物。3、应用生物信息学软件设计通用引物和特异探针，分析其合理性。4、采用酚-氯仿法提取病原体DNA模版。5、不对称PCR制备样品靶序列。6、制备病原体检测芯片：片基处理，按预先设计好的微阵列矩阵