细菌耐药机制的现代概念

细菌耐药机制的现代概念方晓霞福建省龙岩市第一医院364000摘要全球性的细菌抗生素耐药是近年来感染性疾病治疗所面临的一大难题[1][2]，细菌可对某类抗菌药物产生耐药性，也可同时对多种化学结构各异的抗菌药物耐药。随着各种新型抗生素在临床的应用，细菌的耐药也越来越广。本文对细菌耐药机制及自动化仪器检测耐药机理等方面的新进展作简要综述。一、耐药性的分类：细菌耐药性可分为：（1）天然或突变产生的耐药，即染色体遗传基因介导的耐药。属于此种耐药性者如肺炎克雷伯菌和催产克雷伯菌可产生由染色体介导的青霉素酶，因而对氨苄西林和羧苄西林耐药等。（2）质粒介导的耐药性，即细菌因获得了由质粒、噬菌体或其他外来DNA片段，所致的细菌耐药，其所带的耐药基因易于传播，在临床上占有重要地位。二、细菌的耐药机制：（一）β内酰胺类药物耐药针对β内酰胺类抗生素的耐药机制主要有：产生β内酰胺酶；青霉素结合蛋白（PBP）的作用位点改变或产生新的对β内酰胺类抗生素不敏感的PBP；革兰阴性细菌外膜通透性降低和主动外排系统将抗生素泵出胞外。PBPs改变是革兰氏阳性菌耐β－内酰胺类抗生素的最主要机制，β－内酰胺酶是革兰氏阴性杆菌耐β－内酰胺类抗生素的最普遍的机制。（二）β内酰胺酶介导的细菌耐药β内酰胺酶早在β内酰胺类抗生素应用于临床前便已发现，它并不是细菌生长所必需的，因为它的唯一功能是水解β内酰胺。革兰阳性菌的β内酰胺酶分泌到细胞外，而革兰阴性菌的β内酰胺分泌到胞周间隙[3]。最近Bush更新的版本，结合酶的分子结构、抑制特性及水解底物特征来进行分类。见下表（1）β内酰胺的作用机制：β内酰胺是结构类似于细胞壁前体肽聚糖肽酰－D丙氨酰基－D－丙氨酸未端的类似体，能与PBPs和β内酰胺酶互相反应，β内酰胺结合物，PBPs和β内酰胺酶经过连续的酰化作用和脱酰基作用反应，β内酰胺环发生亲核攻击使环打开，并形成通过脂键相连的乙酰酶中间体；通常PBP和β内酰胺酶的主要区别在于酰基化的速率不同，这主要是因为它们对水分子的依赖性不同。对β内酰胺酶来说，水分子是有效的亲核攻击分子，它能迅速水解乙酰酶中间体的脂键使酶再生，并释放β内酰胺部分，细菌产生耐药性。而对PBP来说，乙酰酶中间体对水分子的亲和攻击不敏感，因而乙酰酶中间体不能被水解或水解的速率很慢，从而使PBP失活。（2）革兰阳性菌β内酰胺酶介导的细菌耐药：在青霉素G应用于临床不久，β内酰胺酶便在葡萄球菌中广泛分布。目前90％以上的金黄色葡萄球菌中的β内酰胺酶属于Bush分类的2a组。与革兰阴性菌β内酰胺酶不同，尽管面临着对β内酰胺酶稳定的抗生素的选择性压力，几十年来金黄色葡萄球菌中的产β内酰胺酶、对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌仍然对半合成青霉素（如苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林等）、头孢菌素及碳青酶烯类抗生素敏感。金黄色葡萄球菌β内酰胺酶的产生通常是可诱导的，共涉及至三个基因：blaⅠ、blaR1和blaR2。blaⅠ编码一种抑制因子，对β内酰胺酶结构基因blaZ的转录进行负调节；blaR1编码的蛋白BlaR1包括一个细胞外的区域用来感受β内酰胺类药物，一个细胞内区域负责产生一种信号导致blaZ的去抑制；blaR2基因下调β内酰胺酶的表达，其机制不明。（3）革兰阴性菌β内酰胺酶介导的细菌耐药：尽管革兰阴性菌种发现了多种酶，TEM－1和SHV－1分别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中最主要和最多见的酶。这些分布广泛的酶属于Bush分类2b组，由质粒介导，通过接合、转化和转导等形式使耐药基因在细菌中扩散，可有效地水解青霉素和窄谱头孢菌素酶，但不能水解广谱的氧亚胺头孢菌素、头霉素和碳青酶烯类抗生素，即使这些酶过度表达也不能介导细菌对上述抗生素的耐药，但可导致细菌对酶抑制剂的耐药。20世纪80年代初，随着三代头孢菌素的临床应用，多年来一直稳定的TEM－1和SHV－1酶突然加快了突变的步伐，短短几年由于这两种酶的某些位点的突变而形成的各种超广谱β内酰胺酶在世界各地不断被发现；这些酶介导的细菌对青霉素和一、二、三代头孢菌素以及单环菌素耐药，但对头霉素、碳青酶烯及酶抑制剂敏感，属于Bush分类2b组。从ESBL的分子结构看，其活性作用位点丝氨酸－70位于由四段氨基酸保守序列围成的催化腔底部，β内酰胺类抗生素只有进入催化腔的底部才能被酶水解。ESBL的突变位点一般位于上述保守序列的周围，目前已发现的几十种ESBL其突变位点主要集中在TEM－104、－164、238、－240位点和SHV－179、－238、－240位点，其中164、179、238位点中任一点的突变都将导致催化腔体积的增大，使分子结构较大的三代头孢菌素能够进入；在此基础上104、240等位点的突变将酶对三代头孢菌素的亲和力增强，从而进一步提高其水解效率。另外突变的位点不同其水解效率也不同，如238位点的突变主要促进酶对头孢噻肟的水解，而240、104等位点的突变主要促进酶对头孢他啶的水解，所以抗生素的使用情况不同，ESBL的类型在不同国家和地区是不同的。XTX－M系列ESBL是近年来在世界各地被发现的非TEM和非SHV起源的ESBL，包括CTX－M1－10、Toho－1和Toho－2，它们的主要特征是对头孢噻肟水解力强，而对头孢他啶水解力弱，因此体外药敏试验中产生此酶的菌株常对头孢噻肟耐药而对头孢他啶较敏感。三代头孢菌素的广泛使用引起细菌产生多种新的β内酰胺酶，其中以超广谱β内酰胺酶最具重要意义，主要由肠杆菌科细菌，尤其大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产生；大多由编码TEM－1基因和SHV－1基因突变而形成；多数可为β内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。它可以水解青霉素类、一代、二代、三代头孢菌素和氨曲南，导致细菌对第一代、第三代头孢菌素、替卡西林、哌拉西林和氨曲南耐药，有趣的是，这些酶大多数可被棒酸及舒巴坦抑制，克雷伯菌例外，头霉菌素和碳青霉烯不受影响[3][13][14]。由于其可传播性和对三代头孢菌素表现敏感而引起误导治疗问题，被认为是革兰氏阴性杆菌中最危险的耐药形式[15]，且它的产生使治疗更加困难，抗菌药物的选择范围更窄，目前多选用亚胺培南治疗，ESBL阳性的革兰阴性杆菌应在报告注明，提示医生勿用β－内酰胺类药物。ESBL主要在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中出现，然后又在假单胞菌、不动杆菌、流感嗜血杆菌和奈瑟菌中发现[13][16][17]。当怀疑产ESBL或经验用药治疗失败时，应考虑ESBL产生，避免使用除头霉菌素、卡巴培能以外的其它头孢菌素[18]。AmpC酶的耐药机制：AmpC酶是由染色体介导的β内酰胺酶，属于Bush分类1组（C类），在自然状态下细菌产生此种酶的量很少，但某些细菌如阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌等在β内酰胺类抗生素（尤其是头孢西叮、亚胺配能和克拉维酸）的作用下可大量诱导AmpC酶的产生，而且其调控基因的突变率很高，突变后将使酶持续大量产生，导致细菌对除碳青酶烯类之外的所有β内酰胺类抗生素耐药。AmpC酶的诱导机制很复杂，共涉及四个连续基因，即ampC、ampR、ampD和ampG，并与细菌细胞壁肽聚糖的循环合成有关。近年来此耐药基因已开始向质粒扩散，给临床带来更严峻的挑战。近年也有少数质粒介导的AmpC酶在不同国家被发现。AmpC酶属于ClassC类酶[3]又称头孢菌素酶，它是Bush1类β内酰胺酶的典型代表，能水解青霉素类，一代、二代和三代头孢菌素类和单环类，不被克拉维酸抑制，体外试验尚能诱导细菌产AmpC酶[19]，舒巴坦和他唑巴坦的抑制效果非常有限[20]，但硼酸类化合物和氯唑西林体外有较好的抑制作用。AmpC酶可分为诱导型，去阻遏持续高产型和质粒型。绝大多数革兰阴性杆菌都具有产生AmpC酶的能力，通常情况产酶量很少，在临床上并不形成耐药，但一旦细菌阻遏AmpC酶产生的基因发生突变，细菌就可持续高产AmpC酶，出现对绝大多数β内酰胺抗生素的耐药。此外还应注意到在传统认为只产AmpC酶的肠杆菌属细菌中，ESBL可能并不少见，细菌一旦同时具有高产AmpC酶及产ESBL的能力，其耐药性将极其严重。诱导型AmpC酶：当细菌未接触有诱导力的β内酰胺类抗生素时，染色体的ampC基因被基因阻遏子抑制，产酶处于基线水平。当使用有诱导力的抗生素治疗时，产生了暂时的去阻遏现象。AmpC基因自由表达，使得细菌暂时产生过量的β内酰胺酶。一旦去除抗生素，大多数情况下产酶水平水逐渐恢复到基线水平。临床应用β内酰胺类抗生素阻断了细菌细胞壁五肽交朕桥连接，引起肽聚糖合成紊乱，产生大量肽聚糖片断，当革兰阴性菌周质间隙或胞浆中肽聚糖片段的量超过AmpD蛋白循环利用能力时，感受器或跨膜转运系统AmpG蛋白可传递或摄取肽聚肽聚糖片段的刺激信号，使AmpR蛋白形成激活子，激活ampC基因转录及ampR基因自我转录，诱导细菌产生AmpC酶。大肠埃希菌的AmpC酶低水平表达，它缺少ampR基因而不能诱导产酶[21]。去阻遏持续高产AmpC酶：在产诱导型AmpC酶的革兰阴性菌中，可发生较高频率的调节基因自发突变，调节基因的作用受到抑制[22]，AmpD调节基因突变产生有缺陷的AmpD蛋白，使菌株去阻遏持续高产AmpC酶，亦可产生高诱导型或温度敏感型AmpC酶[23]。质粒型AmpC酶：20世纪80年代以前，AmpC酶多数报道为染色体型，20世纪80年代后有许多文献证实大量使用三代头孢菌素与AmpC酶的产生有密切关系。质粒型AmpC酶的出现与头霉菌素（如头孢西丁和头孢替坦），加β内酰胺酶抑制剂复合抗生素使用量增多产生的选择压力有一定的关系，从分子大小、结构、等电点、生化特性等非常类似于染色体酶，这种酶较超广谱β内酰胺酶有更广泛的耐药谱，又不能酶抑制剂类破坏[24、25]。1988年，Papanicolaou等首次在肺炎克雷伯菌的质粒上捕获到头孢菌素酶，这种耐药性可以转移，并与阴沟肠杆菌ampC基因同源。1994年，在弗劳地枸橼酸杆菌中发现携带头孢菌素酶的耐药质粒，可以转移至大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中，并编码产生AmpC酶，形成质粒型AmpC酶，增加了传播力。目前质粒介导的AmpC酶种类也在不断地增加，现已发现了26种质粒AmpC酶[25]。随着20世纪80年代早期以来新的β内酰胺酶类抗生素的广泛使用，产AmpC酶的革兰阴性杆菌已逐渐成为医院感染的流行菌[4]。1978年首次报道了应用新的β内酰胺类抗生素过程中筛选出产生高水平染色体酶的变异株[26]，它几乎对当前所有的β内酰胺类抗生素（除亚胺培南外）耐药。这种耐药性已在肠杆菌属、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根菌属、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌等临床分离株中报道，并涉及每一种新的头孢菌素类、部分青霉素类和氨曲南[27]。这类报道大多数是肠杆菌属细菌引起的感染。在美国，肠杆菌属造成的医院感染菌血症占5％至7％；在ICU，分别占常见呼吸道感染的第三位，尿路感染第五位，手术伤口感染第四位[28]。其中最常见是阴沟肠杆菌和产所肠杆菌感染，特别当存在以下危险因素时，如长期住院（尤其ICU），严重的基础疾病，各种原因的免疫抑制、高龄、导管装置、抗生素使用等。肠杆菌属感染的爆发流行主要发生在大量使用头孢菌素和其他广谱β内酰胺类抗生素的肿瘤病房或新生儿、心脏外科的ICU。造成感染爆发流行的多种细菌来源于病人自身的肠道菌群。正是由于使用原有的或新的头孢菌素而形成的选择性压力，肠杆菌属细菌逐渐成为肠道菌中的优势菌，最终造成许多病人感染。不仅产AmpC酶的肠杆菌科细菌在医院的流行呈上升趋势，而且这些细菌形成多重耐药的趋势也不断上升。1991年，Chow等[27]对129例成年人研究发现，在肠杆菌属细菌所致的菌血症中，使用第三代头孢菌素治疗比使用氨基糖苷类或其他β内酰胺类治疗更容易导致多重耐药性的产生。这主要与新的头孢菌素的使用增加，以及医院的规模和病人数密切相关。但这种趋势是可以改变的，当减少或终止头孢菌素类的使用时，可减少产诱导酶的肠杆菌科细菌的流行和耐药菌株的出现[27]。2、PBP改变介导的细菌耐药：青霉素结合蛋白（PBP）位于细菌细胞质膜外壁，是在细菌细胞壁肽聚糖合