缺血性心脏病(心绞痛、心肌梗死)药

缺血性心脏病(心绞痛、心肌梗死)药一、实验设计的医学基础根据缺血性心脏病(心绞痛、急性心肌梗死)的主要症状发现，中医将其归属于“厥心痛”、“真心痛”、“胸痹”范畴。病位以心肾为主。基本病机为本虚标实。本虚以脏气亏虚为主．可兼阴虚；标实以血瘀痰阻多见，可兼气滞、寒凝。基本治法为宣痹通阳，活血化瘀，芳香温通及扶正固本。缺血性心脏病可由不同病因引起，最常见的原因是冠状动脉粥样硬化、冠状动脉血栓及冠状动脉痉挛。其共同特点是由于心肌供血不足所致氧的供需矛盾而发生的一系列病理生理改变及证候。改善心脏血管功能，增加心肌的供血供氧，降低氧的消耗，改善心肌代谢，缓解心绞痛，减小心肌梗死面积是药物治疗的主要目的。二、药效学研究的实验设计缺血性心脏病需要进行的药效学实验较多，—般应以整体动物实验为基础，根据药物特点及实验要求适当选用器官、组织、细胞及分子水平的实验，多层次实验相结合，有利于重复验证和说明作用原理。但由于缺血性心肌发病机制复杂，防治的途径，方法及药物类型亦较复杂。应明确研究的思路，作用的途径，选择适宜的主要药效学实验方法及必要的观测指标，进行止确的分析判断，以求得科学的结论。(一)对心肌缺血心肌梗死的防治作用试验1．常用动物模型(1)冠状动脉阻断或缩窄形成心肌缺血和心肌梗死模型：通过阻断或缩窄冠状动脉方法，如结扎、电刺激、气囊法，血管内异物法及注入凝血酶或ADP法等。(2)药物诱发心肌缺血模型：通过药物诱发冠脉痉挛法，如垂体后叶素、麦角新碱，以及通过增加心肌耗氧法，如异丙肾亡腺素等。(3)离体实验心肌缺血模型：结扎离体心脏冠状动脉法、离体心脏低氧或无氧灌流法。(4)体外培养心肌细胞缺血样损伤模型：控制心肌细胞的供氧和培养基中的含糖量，形成“缺血样损伤”模型。(5)心肌缺血冉灌注损伤模型：整体动物心脏缺血再灌注损伤．离体心脏和心肌细胞缺氧缺糖再灌注损伤等模型。以上心肌缺血模型第一项可用于急性和慢性心肌缺血实验，可观察药物的药理作用、起效及作用时间等。其余均为急性心肌缺血模型，可作药物作用机制分析研究。2．观察指标(1)直接测定心肌梗死范围：①大体标本活体染色法，以定量组织学(N—BI'染色或TIC染色或双重染色)观察心肌梗死面积的改变。②病理切片显微镜检查，镜下观测心肌病变程度和范围。③病理切片荧光照相法，利用四环素能与心肌坏死细胞中的钙整合的特性，在切片上进行荧光照相，以测定梗死面积。④电子显微镜观察细胞膜、线粒体、内质网、细胞核及染色质等心肌细胞超微结构的改变。(2)间接测定心肌梗死范围：①心外膜电图标测法，阻断或缩窄冠状动脉形成心肌缺血及心肌梗死，以多点心外膜电图标测心肌缺血的程度和范围的变化。②酶学指标观测，测定血中磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)等与心肌损伤相关的酶类变化，动态观察心肌损伤情况，定量分析心肌损伤程度。③核示踪法，将肘心肌坏死有亲和力的物质进行核索标记来观察梗死情况，常用的有锝—四环素和锝—焦磷酸亚锡。(3)缺血区测定指标：①染料及荧光素法，通过从冠脉注入染料或荧光素，然后进行肌切片观察心脏血流灌注情况，从而计算无染料(或荧光)的面积(即缺血面积)，如合并应用N—BT做活体双重染色法可计算梗死面积与缺血面积的比值。②核示踪法，利用放射核铊依靠钠泵进行转运而不能进入缺血或坏死细胞的特点，通过闪烁照相来观察心肌缺血部位及范围。③放射自显影法观察缺血区。④心表面荧光法，用表面荧光照相来分析缺血K情况。⑤冠脉血流量、冠脉返流量及返流压的测定。⑥心肌区域血流量的测定。(4)其他可供分析的指标：心肌代谢指标，如心肌氧代谢，其他物质及能量代谢，如FFA、ATP、PGI2、TXA2、cAMP/cGMP，SOD、MDA、乳酸、钾、钙、镁离子、血凝状态及血液流变性等。3．方法学评价以上各项试验方法中，以阻断动物的冠状动脉所致之局限性心肌缺血是目前国内外应用最广泛的方法，通过狭窄或完全闭塞冠状动脉，使其供应区的血流减少或缺无，造成心肌缺血，心肌因缺血、缺氧而发生代谢紊乱，以致发生凝固性坏死，其发病过程和机制与临床相似，与中医理论“瘀血证”有一定联系，较为合理、实用。可根据所试药物功能、主治和作用特点选用上述形态、电生理、生化、放免、核示踪、荧光等观测指标与方法，可以定位、定性、定量的观测缺血心肌的动态变化及药物影响，较为准确的评价药效。应作为新药主要药效学的首选试验。(二)对心脏血流动力学及心肌耗氧量影响试验1．实验动物与观测指标(1)犬心功能及血流动力学实验：观察指标应包括心电图、心率。动脉血压、冠脉流量，冠脉阻力、心输出量、心肌收缩力、左室做功、左室内压、左室内压最大上升速率、心搏出量、心脏指数、心搏指数、总外周阻力等，并可同时测定心肌耗氧量、氧利用率、耗氧指数等。(2)猫、鼠等其他动物心功能及血流动力学试验：观察指标应包括心电图、心率，动脉血压、心输出量、左室内压、左室内压最大上升速率、中心静脉压、左室别血的张力指数、左室作功指数、心脏指数、左室舒张未期压等。(3)无创性心功能检查：如超声心动图、阻抗图、Y—照相等。2．方法学评价心脏血流动力学、心肌耗氧量等应作为评阶药物作用及作用机制的重要指标，对于了解药物对心肌功能、血管顺应性、心肌供血及心肌氧代谢的影响，结合对心肌缺血、心肌梗死等指标的影响，作综合性评价有重要意义。(三)其他试验1．血小板聚集性试验血小板聚集性增强是造成血液循环障碍导致心肌缺血发生的重要原因之一。药物对动物血小板聚集性的影响可作为药效学研究的辅助指标。实验动物用兔或大鼠。以三磷酸腺秆、花生四烯酸(AA)、胶原、凝血酶等作为绣导剂，应用比浊法或其他方法测定。2．血栓形成及溶栓试验冠状动脉血栓形成是直接导致心肌缺血因素之一。对血栓形成的影响和溶栓作用应为评价治疗心肌缺血药物药效的辅助指标。常用免或大鼠以Chmldlcr血栓形成法，测定心栓的重量及长度；应用大鼠以动—静脉旁路法测定血栓湿重；电刺激人鼠颈总动脉形成动脉血栓，用以观察药物对体内血栓形成时间的影响;电刺激犬或猪的冠状动脉形成冠状动脉血栓，以心肌缺血程度范围、心肌梗死、心肌酶及冠脉血栓占管腔的百分比等多项指标综合观察药物对心肌缺血的防治作用和溶栓作用。3．血液流变学试验心肌缺血发生前后，常伴有血液流变学改变。因此，测定血液黏度、血浆纤维蛋白原含量、血细胞比容、红细胞沉降、血小板黏附和聚集等血液流变学指标，对评价药物的作用有重要意义。4．氧代谢试验增加心肌的供氧和提高心肌的耐缺氧能力，改善心肌能量代谢是药物治疗缺血心脏病的重要作用。方法除前面介绍的心肌耗氧量测定外，可同时选用小鼠常压、低压耐缺氧等实验和指标。(四)阳性对照药阳性对照药既可选择西药，也可选中药。西药作用明确，疗效肯定，尤其是一些经典药品，可检验实验方法可靠性。西药剂量与中药量相差较大，作用特点亦不大相同，不做药效强度比较。采用中药阳性药时，一股应选疗效肯定的功能主治相似的中成药对照，对照药应是药典记载或经卫生部批准生产的；对照药剂应与受试药等效或相当，以便进行比较，同一受试药的不同药效学实验选用不同的阳性对照药。三、动物模型建立方法(一)犬或小型猪心肌缺血及心肌梗死模型1．原理通过缩窄或完全闭塞冠状动脉，减少或停止供应区的血流，形成心肌缺血、缺氧而发生代谢紊乱，以致发生心肌坏死。2．方法健康成年犬或小猪(现我国已培育出实验用“中国实验小型猪”)，雌雄兼用，体重10—15kg，经戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，手术台固定，分离气骨并插管，连接电动呼吸机，调节潮气量300—600wi，动脉氧分压维持在12—13kPa(90-100mmHg)，血pH在正常范围；左侧第四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，做心包床；分离冠状动脉左前降支中段(一般相当厂第三分支根部)，可用以下儿种方法阻断冠状动脉，形成心肌缺血：(1)冠状动脉结扎法：在冠脉分离处穿3—4号处线以备结扎，或用动脉夹阻断，一般用于急性心肌缺血实验。(2)冠状动脉血栓形成法：将弧型针状电极(刺激电极)置于分离的冠状动脉下，另一电极(参考电极)距刺激电极o．6mm处置于心外膜下，两电极分别连接电刺激仪的隔离器正负极，以2．5、lmA直流电刺激冠状动脉30min左右，冠状动脉内血栓形成，阻断冠状动脉血流，诱发心肌缺血。(3)冠状动脉气囊压迫法：压迫环由有机玻璃外套和可膨胀的乳胶小囊构成，外套长5mm侧面lmm的缝隙，血管由此进入肺内，小囊长3—4mm，一端密闭，一端与塑料管相连，充满蒸馏水或生理盐水，经塑料管注水30—40ul使小囊膨胀以压迫套内的血管，当压力去除时，小囊恢复原状，冠状动脉重新通畅，适用于急性和慢性心肌缺血或再灌实验。(4)Ameroid缩窄环法：为形成慢性冠状动脉闭塞、心肌缺血或观察冠状动脉侧支循环的变化，用具有吸水性的塑料环(Ameroid环)套在冠状动脉左旋支根部。关闭胸腔后，塑料环吸收组织水分膨胀，环外壳系硬质材料做成，限制环的外展，结果压迫冠状动脉，形成心肌缺血。环植人4—6星期，血骨内径缩小80％-90％。(5)清醒动物心肌缺血实验：将气囊压迫环固定在冠状动脉适当部位，缝合心包，放置心包膜电极，气囊的导管电极的导线分别穿过胸壁引出皮外，逐层缝闭胸。实验时注入蒸馏水，使气囊膨胀，压迫冠状动脉造成心肌缺血，测量心外膜电图或其他观察指标,本法可反复阻断冠状动脉，进行多次清醒动物的心肌缺血实验及再灌注损伤实验。(6)缺血再灌注创伤：在心肌缺血一定时间造成心肌损伤后，冉供血一定时间，加重心肌损伤而形成再灌注损伤，观察药物的保护作用。3．药物疗效判断(1)心外膜电图标测：心外膜标测点的定位应包括缺血中心区、边缘区和非缺血区，标测方法：将心电极固定于具有一定弹性的无刺激性材料作成的片子上，该片四角缝于心外膜，如多点固定式心外膜电极。或直接将每个电极固定于心外膜表面，或用一个灯芯电极按顺序点测标测点。或用一个电极沿心表山一定途径移，记出一个连续的心外膜电曲线。电极用浸泡生理盐水的烛芯棉线或细毛笔尖等柔软材料探查电极，联于心电图胸前导联描记，用普通心电图机或多导生理记录仪记录。确定心肌缺血以ST段抬高作为指标，以ST段抬高≥2mv的点数(N—ST)代表心肌缺血的范围，以各点段抬高的毫伏数之和(∑—ST)代表心肌缺血的程度。记录阻断冠脉血流前后的变化及药物的影响。(2)缺血区及梗死区面积的测定：在阻断冠状动脉血流孔后，经左心耳根部向心房注人碳索墨水1．5ml／kg，20-30s注完，迅速取下心脏，冰冻30—40min，在冠状动脉结扎线下．平行冠状沟等厚度将心室部分横切成5片，分别称重，再用求积仪或电脑图分析仪测量每片心肌两面的墨水染色区与末染区(缺血区)，计算心肌缺血范围的重量及百分比。然后将5片心肌置硝基四氮唑蓝(N—BT)染液中，震摇染色15min后取出，正常心肌染为暗蓝色，梗死区心肌则小着色或浅黄色，用求积仪或落点求积法或电脑图像分析法测量每片心肌两面的梗死区和非梗死区，计算出每片心肌总面积、总重量；缺血区和梗死面积和重量；计算缺血区占心室百分比，梗死区占心空白分比，及梗死区占缺血区百分比，以评价药物的疗效。(3)生化指标：阻断冠状动脉前后定时抽取血液，测量血中乳酸脱氢酶的变化，分析心肌损伤情况。为避免具他肌肉组织释放的酶干扰，测同工酶。同时可测定血ATP、cAMP／cGMP、无机离子、代谢物、能量代谢物质等，如需了解药物作用与前列腺素的关系，可观察PGl2或代谢产物的变化，以观察药物对的影响。如需了解药物与氧自由基的关系，可测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)作为氧自由基产生和清除的观测指标。(4)血液流变性指标测定：阻断冠状动脉前后定时抽取血液，测定全血黏度、血浆纤维蛋白原含量、血细胞比容、红细胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流变学指标。4注意点犬和小型猪是建立心肌缺血模型最常用的动物，其体积大小适中，性情温顺、易训练、心脏解剖及生理特点与人相似，其影响因素有：(1)动物冠状动脉分支及侧支循环有个体差异，对分支及侧支变异大的，不合标准的应剔除不用，各组动物模型心肌缺血程度和范围接近。(