植物DNA和RNA提取方法

实验一植物基因组DNA的提取一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。三、实验材料水稻幼叶四、主要试剂配方2%CTAB抽提缓冲溶液:CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml(PH8.0)0.5MEDTA8ml，先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,冷却后0.2-1%2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。五、实验步骤1.DNA的提取（1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；（3）加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；（4）将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；（6）冷却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3min，使两者混合均匀；（7）放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；（8）10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；（9）10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；（10）60sec后，直立离心管，加入720µl的75%乙醇及80µl5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；（11）放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；（12）10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800µl75%的乙醇，将DNA再洗30min；（13）10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；（14）加入50µl0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解；（15）置于-20℃保存、备用。2.DNA质量检测琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。六、注意事项（1）叶片磨得越细越好。（2）移液器的使用。（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。思考题：1.本实验中所用到的各试剂的作用是什么?CTAB,氯仿,异丙醇,75%乙醇,EDTA2．提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？实验二多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。二、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。1．变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2．退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。3．延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。三、实验材料及相关试剂基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等四、实验步骤1．模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。2．PCR操作(在冰上操作)：（1）PCR反应混合液的配制：反应体系25µL,在无菌的0.2mL离心管中按下列操作程序加样：反应物加样顺序体积/µL终浓度ddH2O117.3×n10xBuffer22.5×n1x25mmol/LMgCl231.5×n1.5mmol/L10mmol/LdNTP40.5×n200µmol/L10µM上游引物51×n0.4µmol/L10µM下游引物61×n0.4µmol/LDNATaq聚合酶70.2×n1U（2）将反应混合液混匀,然后每个PCR管中分装24µL反应混合液，再加1µL模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发,然后稍离心。（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：94℃4min(预变性)94℃30sec,60℃30sec,72℃2min72℃7min35个循环（4）注意事项由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。a.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。b.操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。c.每加一种反应物，应换新的枪头。3．PCR产物的检测：琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5µl/100mlTBE）（1）制胶（以150mL为例）a.称取1.8g琼脂糖，加入150ml的TBE缓冲液（pH8.0），摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。b.电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量;c.用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），倒入其中，直至厚度为4～6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~45min)；d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。（2）点样a.将2.0µl溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；b.每孔点样10.0µl，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。（3）电泳打开电源开关，调节电压至3~5V/cm(约100V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。（4）染色将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中,染色15-20分钟。（5）观察将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。（6）注意事项a.煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。b.煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。c.倒胶注意厚度（4-6mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。d.加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。e.一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。思考题：1．PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？2．为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？3．用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？实验三植物总RNA的提取一、实验目的通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法二、实验原理RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。三、仪器、药品与试剂配方(一)仪器1．低温离心机2．分光光度计3．琼脂糖胶电泳系统，用前先用1%NaOH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸泡冲洗。4．高压灭菌锅5．研钵、剪刀、一次性手套等(二)药品1.焦碳酸二乙酯(DEPC)2.吗啉代丙烷磺酸(MOPS)3.异硫氰酸胍4.醋酸钠(NaAc)5.氯仿6.苯酚7.甲醛8.乙醇9.乙二胺四乙酸(EDTA)10.琼脂糖11.异丙醇(三)试剂配方1．0.1%DEPC水0.1mlDEPC加入100ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。2.2mol/LNaAc、0.5mol/LEDTA、4mol/L异硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。3.5ΧMOPS电泳缓冲液(pH7.0)MOPS0.1mol/LNaAc40mmol/LEDTA5mmol/L四、实验步骤（一）总RNA的提取（方案一）1.实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2g幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10mL离心管。加入4mol/L异硫氰酸胍4mL苯酚3mL2mol/LNaAc(pH4.8)0.3mL氯仿0.6mL混匀，冰浴放置30min。2.4℃，8000r/min，离心13min。3.弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。4.加入2倍体积无水乙醇，-70℃，0.5h。5.4℃，8000r/min，离心13min。6.弃上清，在沉淀中加入1mL4mol/LLiCl，使其溶解。7.移入1.5mL离心管中，冰浴2h。8.4℃，13000r/min，离心15min。9.弃上清，在沉淀中加入400uLDEPC水，再加入400uL氯仿，混匀。10.4℃，13000r/min，离心6min。11.取上清,并加入1/10体积3mol/LNaAc（pH5.0），2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min。12.4℃，13000r/min，离心20min。13.将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。14.将沉淀RNA室温下稍干燥。15.加30uLDEPC水溶解，-70℃保存。（二）总RNA的提取（方案二）利用TRIzol提取液抽提RNA，具体步骤如下：1.取幼叶约25