EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析

EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析广州医科大学附属第一医院病理科林毅妍前言•近年来，以表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）为治疗靶标的分子靶向治疗在非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）治疗中越显突出。EGFR基因的检测不仅可以为分子靶向药物的使用提供有效指导，也可以为肺癌治疗措施的制定以及肺癌预后的判定提供重要信息。目前临床病理工作中，对EGFR基因扩增的检测使用较多的方法有荧光免疫原位杂交（FISH）技术、免疫组化（IHC）检测技术、PCR扩增检测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进行比较分析。材料•标本来源：广州医科大学第一附属医院2010年1月～2011年1月行支纤镜及手术切除的NSCLC病例，其中男性21例，女性19例；年龄30～85岁，中位年龄58岁。所有标本均经10%中性缓冲福尔马林液固定，常规石蜡包埋。40例标本行连续切片，同时行FISH检测与免疫组化检测。主要试剂与仪器•蛋白酶K，探针：GLPEGFR/CSP7探针（北京金菩嘉公司），胃蛋白酶消化液，人抗EGFR单克隆抗体（即用型）购于福州迈新生物公司。Dako杂交仪、观察用OlympusBX51型显微镜和NikonH600L荧光显微镜。检测方法•（1）FISH检测：3μm组织切片TO脱蜡至水煮沸去离子水处理15min室温下2×SSC中漂洗2次，每次5min在组织上滴加蛋白酶K工作液，在37℃预热的孵育盒中消化3～5min室温下用2×SSC溶液中洗涤2次，每次5min，乙醇梯度脱水，自然干燥避光环境中，探针混合液滴于玻片杂交区域在温度80℃的自动杂交仪中变性5min，42℃杂交16小时第二天46℃水浴箱中2×SSC10min，0.1%NP40溶液洗涤5min，室温70%乙醇3min暗处自然干燥玻片后加DAPI复染液，放于暗盒中复染5minOlympusBX51型荧光显微镜在DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号检测方法•（2）IHC检测：3μm组织涂胶片，57℃烤片过夜，浸于二甲苯中脱蜡至水在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在37℃预热的孵育盒中消化30min采用EnVision二步法，严格按照说明书操作结果判断•（1）FISH结果判定：红色信号代表检测的靶基因，绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测EGFR基因计数100个细胞，统计Ratio值（100个细胞核中红色信号数/100个细胞核中绿色信号数）。FISH阳性分为：EGFR基因扩增：①Ratio≥2为阳性结果；②≥15个红色信号的细胞数占细胞总数的10%以上；③出现成团红色信号的细胞；高多体性：Ratio＜2，但≥4个红色信号的细胞数占细胞总数的40%以上。FISH阴性：Ratio＜2为无扩增。结果判断•（2）IHC结果判定：染色结果根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。•着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分；6～25%阳性细胞为1分；26～50%阳性细胞为2分；＞50%阳性细胞为3分。•再结合染色强度，无色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘，为其最后得分。•同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最后得分。0～1分为阴性（－），2～3分为弱阳性（1+），4～6分为中等阳性（2+），6分以上为强阳性（3+）。统计学处理•采用SPSS17.0统计软件进行描述性分析。•FISH技术与IHC法检测结果的比较使用x2检验。结果FISH图1.EGFRFISH（+）（高多体）图2.EGFRFISH（+）（点簇状）图3.EGFRFISH（-）结果IHC++++++-结果•FISH技术与IHC法检测EGFR的结果比较见表1。FISHIHC合计（-）（1+）（2+）（3+）（+）652215（-）1951025合计20103240•表1FISH技术与IHC法检测EGFR的结果比较40例NSCLC标本中，FISH显示为阳性的15例，其中IHC检测EGFR表达为（—）的6例（40%），阳性的9例（60%）；FISH显示为阴性的25例，其中IHC检测EGFR表达为（—）的19例（76%），阳性的6例（24%）。IHC检测阳性例数高于FISH检测阳性例数，差异无统计学意义（x2=5.184，P＞0.05）。讨论•表皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，位于第7号染色体p13～22区,全长200kb,由28个外显子组成，编码1186个氨基酸[1],广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。EGFR的异常高表达可见于多种恶性肿瘤，其活化可激活多种转录因子,引起细胞的增殖、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应，在肿瘤进展、血管生成、转移扩散、凋亡受抑等方面起重要作用[2]。EGFR酪氨酸激酶抑制剂可抑制激活EGFR的酪氨酸激酶活性，从而阻断EGFR的功能，阻碍肿瘤的发生发展[3]。多数文献提示，分子靶向治疗晚期NSCLC疗效明显，而且治疗明显的患者中，EGFR基因突变的发生率明显高于治疗无效的患者，EGFR基因检测可以作为患者应用分子靶向治疗的一个预测指标，在NSCLC个性化治疗过程中提供重要信息。讨论•FISH技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中标本受影响较少，可以定量判读结果。•IHC法是临床常用的EGFR蛋白表达的方法。该方法操作简便，可重复性高，对仪器、材料的要求不高，是国内检测EGFR蛋白表达的主要方法。但IHC法在标本固定和处理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果，易造成假阴性或假阳性，且结果判断人为主观性较强。由于免疫组化方法因抗体类型与来源不同，以及所使用的评分系统的差异而导致结果差异，不同抗体可使结果范围从12％变至14％[4]。讨论•以FISH为标准，IHC与之比较：•2例IHC法强阳性（3+）标本中，FISH检测EGFR基因扩增均为阳性，阳性预测值为100%；•3例IHC中等阳性（2+）标本中，FISH检测EGFR基因扩增阳性为2例，阳性预测值为66.67%；•10例IHC弱阳性标本（1+），FISH检测EGFR基因扩增阳性为5例，阴性预测值为50%；•25例IHC阴性（-）标本中，FISH检测EGFR基因扩增阴性为19例，阴性预测值为76%。•总体而言，两种方法的符合率较低。但其中IHC法EGFR表达（3+）及（2+）的标本，尤以强阳性（3+）标本与FISH检测EGFR基因阳性的一致性较高，与有关文献报到有所不同[5]，但该类标本例数较少，仅占总例数的12.5%，其一致性是否可靠需要进一步验证。讨论表2.2963例乳腺癌HER-2的IHC和FISH检测结果比较以FISH作为标准IHC与之比较，其阳性预测值在IHC阳性(+++以上)标本中为91.6%，阴性预测值在IHC阴性(0或+)标本中为97.2%，在IHC弱阳性和阳性(0或+)标本中其敏感性为92.6%，在IHC阳性标本中其敏感性为98.8%[6]。讨论•综上所述，免疫组化法对于评价患者是否使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗并非最佳的手段，但可作为筛选检查。参考文献•[1]ReiterJL,ThreadgillDW,EleyGD,etal.ComparativegenomicsequenceanalysisandisolationofhumanandmousealternativeEGFRtranscriptsencodingtruncatedreceptorisofornls[J].Genomics,2001,71(1):1.•[2］JorissenRN,WalkerF,PouliontN,etal.Epidemalgrowthfactorreceptor：Mechanismsofactivationandsignaling[J].ExpCellRes,2003，284（1）:31.•[3]CunninghamD,HumbletY,SienaS,etal.Cetuximabmonotherapyandcetuximabplusirinotecaninirinotecan-refractorymetastaticcolorectalcancer[J].NEnglJMed,2004,351(14):337-345.•[4]BuckleyAF。Kakars．comparisonoftheDakoEGFRpharmI)xkitandZymedEGFRantibodyforassessmentofEGFRstatusincolorectaladenocarcinoma[J]．AppllmmunohistochemMolMor_phol，2007，15(3)：305—309．•[5]周晓秋，王东关，孙希印，高摇虹，王琳琳，李新功.非小细胞肺癌耘郧云砸基因和蛋白检测的比较分析[J].临床与实验病理学杂志，2012,28（10）：1124-1132.•[6]刘艳辉.乳腺癌组织HER-2的荧光原位杂交和免疫组化联合检测的评价[J].循证医学，2006，6(2)：81-83.