胶滴肿瘤药敏检测技术的研究进展

胶滴肿瘤药敏检测技术的研究进展梁智张伟中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所摘要：胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)是一种体外肿瘤药敏检测技术，其突出特点是能够排除成纤维细胞对实验的干扰，在体外对抗癌药物的特异性杀伤作用做出客观评价，同时所需标本量小（3×103个细胞/孔）的特点扩大了该技术的应用范围，弥补了目前其它药敏技术的不足。国外临床研究表明此技术的体外检测结果与临床疗效间存在较好的相关性。CD-DST技术作为一种先进的体外肿瘤药敏检测技术，对化疗药物杀伤肿瘤细胞有效性的评价、化疗方案的筛选以及肿瘤化疗个体化治疗的推广均具有实际意义。国外研究表明，该技术的应用能够提高恶性肿瘤患者的疗效和临床医师用药的科学水平。关键词：肿瘤药敏检测胶滴肿瘤药敏检测技术(CD-DST)中图分类号R730.5文献标识码AAdvancesoncollagengeldropletculturedrug-sensitivitytestLiangZhiZhangWeiAbstractCollagengeldropletculturedrug-sensitivitytestisavitrochemosensitivityassay。Itcaneliminatetheeffectsoffibroblastsbyemployingimageanalysis,evaluatetheefficacyOfanticancerdrugs.Furthermore,theCD-DSTsolvessomeproblemsinherentinotherconventionalassaysbyusingarelativelysmallnumberofcells(3×103cell/30ul).TherewasastatisticallycorrelationbetweenclinicallyreportedresponseratesandtheresponseratesobtainedbyCD-DST.Itappearstobeusefulinexploringthepossiblecombinationplotsandprinciples,evaluatingtheefficacyofexistingchemotherapy,andoptimizechemotherapyonanindividualbasis.Therefore,CD-DSTcanbeusedtoimproveandguidetailoredchemotherapyinthefuture.KeyWords:tumorChemosensitivityassayCD-DST恶性肿瘤是一类严重威胁人民生命和健康的疾病。近年来，某些恶性肿瘤的化疗效果有了明显提高，但多数肿瘤尤其是实体瘤疗效仍不理想。由于肿瘤异质性的存在，使不同的肿瘤类型或同一肿瘤类型的不同病人对药物的敏感性不同，治疗效果差异很大。例如胃癌患者的单药有效率仅为15%-30%，MMC有效率为30%，5-Fu有效率为21%，EDI有效率为19%，联合化疗的有效率也仅为30%-50%[1]，可以看出目前肿瘤的临床化学治疗具有一定的盲目性。此外由于化疗药物多具有细胞毒性,不当的治疗不仅会贻误治疗，还会产生严重的毒副作用和联合耐药，最终导致治疗失败。因此，如何提高化疗用药的针对性和准确性，科学的使用化学药物是肿瘤化疗中需要解决的实际问题。自人们20世纪50年代有人提出对肿瘤病人进行个体化治疗以来，国际上相继建立了一系列体内、外药物敏感性试验技术。目前具有代表性的有以下几种体外药敏实验：琥珀酸脱氢酶抑制实验（SDI）[2]、四唑蓝比色法(MTT)[3]、ATP生物荧光体外药敏检测法（ATP-TCA）[4]及立体组织培养药物测定实验（HDRA）[5]。这些方法不同程度的部分解决肿瘤个体化治疗的问题，但均存在所需细胞数量多，不能解决小量标本进行药敏检测的问题。在此种研究背景下，人们建立了胶滴肿瘤药敏检测技术(collagengeldropletculturedrug-sensitivitytest，CD-DST)。CD-DST技术克服了其它方法的缺点，具有所需细胞数量少、敏感、快速及临床相关性好的特点[5]，是一种先进的体外药敏检测技术，在临床应用中具有广阔发展前景。现就其原理、特点及临床应用作一介绍。1.CD-DST原理及技术特点1.1CD-DST技术原理由于人体内的肿瘤组织是由肿瘤细胞、正常细胞和细胞外基质共同组成的细胞群体，肿瘤细胞生长的微环境对肿瘤细生长产生重要影响。CD-DST技术是利用胶原凝胶在37℃时形成的三维立体结构的特点，在体外模仿了体内肿瘤细胞生长的微环境，使肿瘤细胞能够在与体内环境相似的条件下生长，生长的肿瘤细胞具有与体内相似的细胞形态特点。经过7天的培后，经干胶、染色、扫描等程序最终对化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用程度做出客观评价。如图1所示，CD-DST技术利用胶原酶消化细胞外基质，将肿瘤单细胞包埋于Ⅰ型胶原中，形成胶原凝胶，肿瘤细胞在三维立体环境中生长，然后在近似于体内环境的条件下中评定药物对细胞的作用[6]。图1：CD-DST技术原理1.2CD-DST技术技术特点1979年，YangJ等[7]提出了一种新型体外细胞培养技术，将乳腺癌上皮细胞种植到胶原中以形成三维立体结构，从而达到使其生长类似于体内细胞生长状态。随后MillerBE[8]及NakagawaH[9]等人证实了肿瘤细胞在胶原中培养具有克隆形成率高、与体内细胞形态相似的特点，将此技术应用体外药敏实验。1997年KobayashiH等[10]采用此种细胞培养技术，结合其他体外药敏试验优点，报道了CD-DST这种新的体外药敏检测技术。CD-DST技术具有以下特点[6,10,11]：①细胞用量少（3×103个细胞/孔）由于所需标本细胞数量少，不仅可对小量的组织标本进行药物敏感性测定，而且可以对胸腹水等液体标本进行检测。从而使乳腺针吸活检标本、胸水标本、组织活检标本可以进行体外药敏检测，扩大了肿瘤药敏技术的检测范围。②标本培养成功率高肿瘤细胞在胶原凝胶所形成的三维立体培养环境中，培养成功率高，细胞具有与体内细胞相似的生长形态。如图2所示，肿瘤细胞在胶原凝滴培养与SDI培养相比较具有较高的生长率。图2：肿瘤细胞在胶原凝滴培养和SDI培养细胞生长率比较[11]③采用图象软件系统分析结果，客观准确通过图象软件系统进行分析，排除成纤维细胞对实验的干扰，可对抗癌药物对肿瘤细胞的特异性杀伤作用在体外做出客观评价。研究报道肺癌细胞和成纤维细胞经过中性红染色，具有明显不同的特点，结果如图3。图3肺癌细胞和成纤维细胞的生长形态[10]A.肺癌细胞克隆B.比较肺癌细胞和成纤维细胞经过中性红染色的区别④结果测定快速（3秒/滴）结果利用计算机进行结果分析，测定6种药物的时间只需1分钟。1.3CD-DST技术流程CD-DST肿瘤体外药敏检测操作流程[12,13]主要为以下流程（图4）：图4：CD-DST技术实验流程1.肿瘤细胞悬液制备：将新鲜瘤组织剪碎成0.5-1mm碎块，加入消化酶（胰酶、胶原酶）消化2～3小时，待细胞分散后,通过80um的筛网过筛，得到细胞悬液。2.肿瘤细胞的原代单层培养：将上述细胞悬液加入到I型胶原蛋白包被的细胞培养瓶中培养24小时,弃上清中未贴壁的死细胞。3.胶原蛋白凝胶内培养：将细胞用胶原酶消化后，收集活细胞并计数，将活细胞滴入胶原凝胶液中。将胶原和细胞混合物接种于六孔板37℃培养，1小时后加入培养基，培养过夜。4.待测药物的添加：在六孔板中加入抗癌药物，在不同药物浓度作用下培养24小时。清洗并除去抗癌药物后，无血清培养7天。5.结果测定：中性红染色固定、扫描，结果传输计算机。利用图象软件分析药物的抑制率，评估药物体外杀伤作用。6.结果评价：通过图象软件，对图象进行分析。在设定亮度值128为阈值，排除亮度值在128-255之间的成纤维细胞，直接对亮度值在0-128之间的肿瘤细胞形成的克隆进行光密度的计算（D），结果传输到计算机，计算出分析药物的抑制率。D=㏒10（投射光总量/透射光总量）药物体外敏感性用T/C的百分比值表示，其中T为加药处理组的的光密度值，C为空白对照组光密度值。如果T/C的百分比值≤50%则认为药物在体外敏感。2.国际上CD-DST临床相关性研究2.1标本可评价率研究KobayashiH等人研究表明[14]，CD-DST技术标本可评价率较高，不同肿瘤类型标本的总体评价率为82%，结果如表1所示。经过统计学分析可发现不同类型的肿瘤标本的可评价率均无显著差异。同时通过对小量标本（针吸和活检）进行药敏实验，标本总体评价率为78.6%，结果如表2所示。因此CD-DST技术对小量标本的检测同样具有标本可评价率高的特点，可以弥补目前其它体外药敏技术无法对小量标本进行检测的不足。表1：不同肿瘤类型CD-DST标本可评价率肺癌乳腺癌胃癌结肠癌食管癌胰腺癌胆管癌脑部肿瘤标本数量659163921071317832可评价标本54313278891117828评价率（%）828185838510010088标本总评价率=83%表2：活检标本可评价率乳腺针吸活检标本胸水标本胃组织活检标本食管组织活检标本标本数量5872513可评价标本495189评价率（%）85717269标本总评价率=78.6%2．2药物体外敏感性和临床单药治疗有效率的比较研究药物体外敏感性和临床单药治疗有效率的比较结果如表3所示，经过统计学分析，可以发现药物体外敏感性结果和实际临床单药治疗有效率有较高的吻合率。表3：药物体外敏感性和临床单药治疗有效率[14]抗癌药物肿瘤类型体外敏感率(%)临床反应率(%)CDDP肺癌23.425乳腺癌13.88胃癌14.325MMC肺癌23.919乳腺癌14.820胃癌26.8315-FU肺癌--乳腺癌27.926胃癌35.3232.3CD-DST体外药敏测定结果与临床疗效的相关性研究1996年，InabaM等[15]首先证实此方法在体外进行药物敏感性检测的可行性，随后进行了临床相关性研究[16,17]。体外药敏检测的肿瘤标本包括胃肠道肿瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌，食管癌等多种肿瘤类型。研究资料统计结果表明CD-DST体外药敏测定结果与临床疗效具有较好的相关性[14]，其中阳性预测值为79.8%﹑阴性预测值为88.8%﹑特异性为80.6%。表4：CD-DST测定结果与临床疗效相关性研究结果[14]CD-DST/临床反应S/SS/RR/SR/R总计非小细胞肺癌4413546108乳腺癌24342657胃癌430310食管癌20114脑部肿瘤10034总计75191079183S：敏感性R：抗药性预测精确值84.1%（154/183）阳性预测值79.8%（75/94）阴性预测值88.8%（79/89）敏感性88.2%（75/85）特异性80.6%（79/98）3.CD-DST技术在临床中和科研中的应用3.1指导临床化疗用药，设计个体化治疗方案。建立可靠的体外肿瘤药敏检测方法，可以帮助临床医师选择有效的化疗药物，有的放矢的设计个体化治疗方案，提高临床治疗效果。国外研究结果表明，CD-DST辅助临床进行化疗方案的确定，取得了较好的临床效果。Yabushita等[18]报道了CD-DST指导下的化疗在卵巢癌治疗中应用，4名患者在CD-DST指导下进行辅助化疗，24到36个月之间均未复发。5例患者进行在CD-DST指导下进行诱导缓解化疗，3例达到完全缓解，1例达到部分缓解,有效程度明显高于常规化疗。TakamuraY等[19]以CD-DST指导70例乳腺癌患者的临床治疗,其中59例标本可评价，标本评价率为84.3%。根据CD-DST检测结果，32例对药物敏感的患者，临床治疗有效的为28例；27例对药物抵抗的患者，临床治疗有效的仅为1例。另外在20例可评价的乳腺癌复发的患者中，药物敏感组患者的中位缓解期为15.9个月，体外抗药患者的中位缓解期为2.5个月。结果表明，CD-DST辅助化疗的应