第二章-天然药物化学成分的提取-分离和鉴定方法

NaturalProductsChemistry第二章天然药物化学成分的提取、分离和鉴定[基本内容]中药有效成分的提取方法。溶剂法、水蒸气蒸馏法、升华法、超声波提取法、超临界提取法、微波提取法、仿生提取法、生物提取法。中药有效成分的分离方法。1.根据溶解度差别进行分离——沉淀法、结晶法。2.根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离3.根据物质的吸附性差别进行分离——吸附色谱法4.根据物质离解程度不同进行分离—离子交换法5.根据物质分子大小差别进行分离—凝胶滤过法6.根据物质的沸点差别进行分离—分馏法1H-NMR、13C-NMR在结构研究中的的作用及解析方法本章内容第一节提取方法第二节分离方法第三节结构研究方法4提取前准备1）文献调研，选择合适的提取方法2）药材预处理：粉碎、脱脂除色素第一节提取方法第一节提取方法1.溶剂提取法2.水蒸气蒸馏法3.升华法4.超临界流体萃取法5.超声波提取法6.微波提取法第一节提取方法1.溶剂提取法（extractionwithsolvent）原理：相似相溶理想溶剂（idealsolvents）有如下特点（1）对有效成分溶解度大；（2）对无效成分溶解度小；（3）与有效成分不起化学反应；（4）安全，成本低，易得。※溶剂的极性由弱至强的顺序：石油醚〈氯仿〈乙酸乙酯〈正丁醇〈丙酮〈甲醇〈水水、亲水性有机溶剂、亲脂性有机溶剂第一节提取方法一、提取法：1.溶剂提取法（extractionwithsolvent）影响提取的因素：①药材的粉碎度：一般以20-60目为度。②温度：对热不稳定的温度不宜过高。③浓度差：搅拌、换溶剂、渗漉。④提取时间：水加热提取1-2小时，乙醇加热1小时为宜。选择溶剂要点：相似相容水溶性亲脂性亲水性苷类（黄酮、三萜、甾体等与糖的结合物）糖类、氨基酸蛋白质、盐类未成盐的生物碱，未成苷的黄酮、蒽醌、萜类、甾体。1溶剂提取法第一节提取方法Simplepercolateassembly1)冷提取法：适用于受热不稳定的成分。浸渍(Maceration)渗漉（Percolation）第一节提取方法浸渍法(Maceration)：是在常温或低热（＜80C）条件下用适当的溶剂浸渍药材以溶出其中成分的方法。优点：用水或有机溶剂，不加热。适用范围：适用于遇热不稳定成分或含大量淀粉、果胶、树胶、粘液质的药材的提取。缺点：出膏率低，用水做溶剂时易发霉，需加防腐剂。第一节提取方法第一节提取方法渗漉（Percolation）：是不断向粉碎的原料中添加新鲜浸出溶液，使其渗过药材，从渗漉筒下端出口流出浸出液的方法。优点：有效成分浸出完全，可直接收集浸出液缺点：消耗溶剂量大，费时长，操作麻烦。渗滤装置工业生产用的渗漉装置第一节提取方法2)热提取法：煎煮法（Decoction）回流（Refluxing）连续回流（ContinuousRefluxing）SimplerefluxingassemblyAssemblyofSoxhletextractor第一节提取方法2)热提取法：第一节提取方法A煎煮法(Decoction)：是在中药材中加入水后加热煮沸，将有效成分提取出来的方法。特点：操作简单，对易挥发、热不稳定的成分不宜用。B回流提取法(Refluxing)：是用易挥发的有机溶剂加热回流提取药材成分的方法。特点：有机溶剂提取时，最常用的一种方法。热不稳定的成分不宜用，溶剂消耗量大，操作麻烦。C连续回流提取法（ContinuousRefluxing）：AssemblyofSoxhletextractor（索式/沙式提取器）优点：节省溶剂、效率高。缺点：对热不稳定成分不宜用，时间长。最省溶剂的提取方法第一节提取方法2.水蒸气蒸馏法（water-steamdistillation）提取具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的成分，如挥发油。Simplewater-steamdistillationrefluxingassembly第一节提取方法不适用：受热不稳定的药材2.水蒸气蒸馏法（water-steamdistillation）第一节提取方法2.水蒸气蒸馏法（water-steamdistillation）第一节提取方法3.升华法（sublimation）用于具有升华性的成分提取，如香豆素，蒽醌，樟脑等。第一节提取方法超临界流体的密度与液体很接近，而它又具有气体扩散性能常用的临界流体有CO2、N2O、乙烷、丙烷等。4.超临界流体提取法（supercriticalfluidextractionSFE)利用溶剂在超临界条件下特殊的流体性能对样品进行提取，为20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法。第一节提取方法控温面板高压泵超临界CO2萃取实验装置示意图原料萃取柱玻璃珠脱脂棉超临界萃取实验装置与实验方法CO2钢瓶PCO2冷温槽恒温箱流量计接收瓶小试实验装置图实验装置－小型实验装置•上世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青•70、80年代，SFE越来越多的用于食品、香料的提取•90年代，开始从植物药中提取目标成分，如从蛇床子、茵陈蒿、桑白皮中提取活性成分。中小型SFE装置图为物理过程，无化学反应，生物活性不减。大能量的超声波产生的极大压力造成植物细胞壁及整个生物体破裂，胞内物质的释放、扩散及溶解。5.超声提取法（ultrasonicextraction)实验室用小型超声仪第一节提取方法工业生产用超声仪6.微波提取法（microwaveextraction）•具有穿透力强、选择性高、加热效率高等显著特点，而且其操作简便、快速、节能、高效。•缺点：工业化设备少、成分变化、生物活性变化。工业生产用微波提取罐第一节提取方法小结1、掌握常用溶剂的极性强弱顺序。2、熟悉天然药物化学提取方法以及各种提取方法的优缺点。本章内容第一节提取方法第二节分离方法第三节结构研究方法第二节分离方法1.根据溶解度差别进行分离2.根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离3.根据物质的吸附性差别进行分离——吸附色谱法4.根据物质离解程度不同进行分离—离子交换法5.根据物质分子大小差别进行分离—凝胶滤过法6.根据物质的沸点差别进行分离—分馏法第二节分离方法1.根据溶解度差别进行分离1.1结晶法（纯化时常用）条件：浓度；合适的溶剂；温度1.2沉淀法a分级沉淀法：改变极性，如水提醇沉法b酸碱沉淀法：改变pH，处理酸、碱、两性成分；c专属试剂沉淀法：如铅盐沉淀法，酸性、酚性成分加中性PbAc2，形成沉淀。d盐析法：水溶液中加入无机盐第二节分离方法1.1结晶法关键：选择合适的溶剂①对被溶解成分的溶解度随温度不同应有显著差别②与被结晶成分不应产生化学反应③沸点适中第二节分离方法a分级沉淀法：改变极性水提醇沉法：含有糖类或蛋白质的水溶液中，分次加入乙醇，使含醇量逐步增高，逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽等。水提醇沉法———除去多糖、蛋白质等水溶性杂质醇提水沉法———除去树脂、叶绿素等水脂溶性杂质在含皂苷的乙醇溶液中分次加入乙醚或乙醚-丙酮混合液可使极性有差异的皂苷逐段沉淀出来。第二节分离方法b酸碱沉淀法：改变pH，处理酸、碱、两性成分；碱性成分：生物碱类与无机酸成盐溶于水，调节pH碱化后生物碱游离出来，在水溶液中沉淀析出。酸性成分：对于具有羧基或酚羟基的酸性成分，与碱成盐而溶于水，酸化后游离出来，在水溶液中沉淀析出。注意：酸碱处理结构的变化。第二节分离方法c专属试剂沉淀法：雷氏铵盐用于分离生物碱与非生物碱类成分，以及水溶性生物碱与其他生物碱的分离；胆甾醇能和甾体皂苷沉淀，可使其与三萜皂苷分离。明胶能沉淀鞣质，可用于分离或除去鞣质。d盐析法：水溶液中加入无机盐三颗针中分离小檗碱2.1影响分离的因素①分离因子β，分配系数Kβ=kA/kBkAkB,k=CU/CL（CU,CL被分离物质在上相和下相中浓度）根据β值的大小可决定分离采用的方法:β≥100，简单的一次萃取，可基本分离.100β≥10，10-12次萃取，CCD法（逆流分配法）。β≤2，100次以上萃取，DCCC法（液滴逆流色谱），HSCCC法（高速逆流色谱）。Β=1，不能分离。第二节分离方法2.根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离或用PC法求β值，选择理想分离条件。•纸色谱（PC）也叫纸分配色谱（PPC，PaperPartitionChromatography）。（纸色谱定数）Rfa，Rfb为A，B两物质在PC上Rf值=第二节分离方法•2.1影响分离的因素②pH值对于酸性、碱性、两性化合物，pH值可改变它们的存在状态（游离型和解离型），分配比受pH值的影响，因为HA达到99%解离时，pH=pKa+2HA达到99%游离时，pH=pKa-2第二节分离方法第二节分离方法2.2酸碱性成分的分离—pH-梯度萃取法、酸碱溶剂法按酸碱性强弱不同分离酸性、碱性、中性物质，改变pH值使酸碱成分呈不同状态。强酸性—NaHCO3,中等酸性—Na2CO3,弱酸性—NaOH应用：黄酮、蒽醌和生物碱的分离pH-梯度萃取法酸碱溶剂法洋金花粗粉30g(揉碎)0.5%HCl(V/V,自配)300ml冷浸30分钟棉花过滤，滤液再用滤纸加硅藻土抽滤一次酸水液取60ml酸水液加浓氨水调PH值至11，加氯仿萃取3次，每次20ml氯仿层（总碱的氯仿液）简单萃取分离极性较大的成分：正丁醇-水分离极性中等成分：乙酸乙酯-水分离极性小的成分：氯仿(或乙醚)-水石油醚——脱脂第二节分离方法2.3溶剂分配法简单萃取法操作方法：第二节分离方法1.小试管预试，检测是否乳化。2.水提取液的比重在1.1-1.2之间。3.有机溶剂用量1/3、1/4-1/6。1、从中药水提液萃取亲脂性成分宜选用溶剂是（）A、乙醚B、乙醇C、甲醇D、正丁醇E、丙酮AB练习2、溶剂法分离中药水提液中成分不宜选用溶剂为（）A、乙醚B、丙酮C、正丁醇D、氯仿E、乙酸乙酯第二节提取分离方法2.3溶剂分配法Sinoodophyllumemodi(Wall.)Ying(18.8Kg)extractedwith95%EtOHEtOHextractsuspendedinwaterpartitionedwithpetroleum,CHCl3,ethylacetate,n-butanolsuccessivelypetroleum(93g)CHCl3(1600g)ethylacetate(157g)n-butanol(480g)waterlayer系统溶剂萃取法第二节分离方法2.3逆流分配法、液滴逆流色谱、高速逆流色谱①逆流分配法(CCD)：多次连续液-液萃取分离过程。特点：条件温和，样品易回收，适用于中等极性、不稳定物质的分离。②液滴逆流色谱(DCCC):一种液-液分配色谱，流动相呈液滴形式垂直上升或下降，通过固定相的液柱，实现物质的逆流色谱分离。特点：不易乳化，样品可定量回收，分离效果好，特别适合于分离皂苷等水溶性成分。缺点：样品处理量小。第二节分离方法③高速逆流色谱（HSCCC）通过特定的高速行星式旋转所产生的离心力场作用，使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管内，并使流动相单向、低速通过固定相，实现连续逆流萃取分离物质的目的。用于各种物质的分离，包括蛋白、酶、三萜、生物碱、皂苷等。第二节分离方法2.4液-液分配柱色谱•①正相色谱：•固定相极性大，如氰基与氨基键和相、水、缓冲液等；•流动相极性小，如氯仿、乙酸乙酯等。载体：硅胶（含水可达17%），硅藻土，纤维素等。分离极性大或中等极性的成分。洗脱顺序：极性小的物质先被洗脱出来。第二节分离方法2.4液-液分配柱色谱•②反相色谱：固定相极性小于流动相。如HPLC反相柱，反相板。固定相：硅胶硅醇基结合烷基，如RP-2，RP-8，RP-18。亲脂性：RP-18RP-8RP-2。流动相(洗脱剂)：MeOH-H2O，CH3CN-H2O洗脱顺序：分离非极性及中等极性的成分，极性大者先洗脱下来。第二节分离方法色谱分离法—分配色谱HPLC1、用含水15%硅胶柱分离化合物A,B,C，并用乙酸乙酯作为流动相，试比较化合物的出柱顺序。