葡萄酒中苹果酸的测定(doc16)(1)

葡萄酒中苹果酸的测定原理:利用MegaQuantTM(专利技术)测定L-苹果酸需要进行三步酶解反应，第一步：在L-苹果酸脱氢酶(L-MDH)的催化作用下，L-苹果酸被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化生成草酰乙酸：(1)L-苹果酸+NAD+(L-MDH)oxaloacetate+NADH+H+第二步：加入过剩的L-谷氨酸，在谷草转氨酶的作用下，生成L-天门冬氨酸和2–酮戊二酸(2)Oxaloacetate+L-glutamate(GOT)L-aspartate+2-oxoglutarate第三步：在心肌黄酶的催化作用下，NADH还原碘硝基氯化四氮唑(INT)，生成甲基-INT(3)NADH+INT+H+(diaphorase)NAD++甲基-INT生成的甲基-INT的量取决于L-苹果酸的量，甲基-INT的吸光度值可在505nm下测量。特异性,灵敏度,测量范围和精确度:该实验方法是专门用于测定L-苹果酸含量的。最小可调吸光光度为0.01个吸光单位，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度为7.7mg/L。如果最小可调吸光光度为0.02吸光光度，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸检测线为15.4mg/L。该实验的测量范围为0.15-15ugL-苹果酸(对于20uL样品液中的浓度为0.007-0.75g/L)，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.01-0.02吸光单位的变化，对于样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度大约在7.7-15.4mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。干扰:红酒中的酚醛树脂会对本试验造成干扰，引起INT的“缓慢反应”（图2），因此在对未稀释的红酒进行测定时，必须首先用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）净化样品。“缓慢反应”同样也发生在未稀释的白葡萄酒中，按照提供的方法进行测定，其缓慢反应速率非常的慢。在用MegaQuantTM测定L-苹果酸的时候，对于存在的两种潜在的次要误差原因的认可是非常有必要的：1.使用PVPP去除了红酒中的大部分酚醛树脂，但是还是存在着“缓慢反应”，由于用PVPP处理过的葡萄酒（导致潜在的高估白葡萄酒中的L-苹果酸0.00-0.01g/L，或红葡萄酒中的浓度0.00-0.03g/L）其中存在的“缓慢反应”非常的慢，因此可以忽略不计（实验方法A），然而，如果想得到精确的结果，可以通过实验方法B精确计算得到。2.推荐使用PVPP药片的测试方法（如每5mL葡萄酒用1个药片）中，导致了对样品浓度进行了2%(v/v)稀释，计算方法中考虑了这一点（请参照用PVPP处理样品方法）还原性物质能够干扰试验，引起“缓慢反应”，如：亚硫酸亚和抗坏血酸盐，但是仅仅能够对浓度不是很高的葡萄酒样品进行测定，如亚硫酸盐浓度在4g/L，如果样品中的抗坏血酸盐含量非常高(400mg/L)，则不能进行测定。向已完成反应的试管中添加L-苹果酸（每20uL添加7.5ug），通过增加的吸光度值进一步验证其他干扰的影响，利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。通过向样品中添加标准质控做定量回收试验，计算样品在处理和提取时的损失。安全性:L-苹果酸测定所使用的试剂没有有毒物质。然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02%w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。试剂盒:MegaQuantTML-苹果酸含量测定试剂盒可以进行60次的测定试验，并提供有全部的试验方法：58次测定试剂盒(cat.no.K-LMALR)瓶1:双甘氨肽缓冲液(100mL,100mM,pH10.0)+L-谷氨酸(100mM)+叠氮化钠(0.02%w/v)稳定性2年，4°C保存。瓶2:药片（60粒）-含有心肌黄酶,GOT,INT,FAD和NAD+，使用前要先恢复至室温在打开稳定性2年，-20°C;干燥保存。瓶3:L-苹果酸脱氢酶(1.3mL,15,000U/mL)稳定性2年，4°C保存。瓶4:L-苹果酸质控标准液(5mL,0.375mg/mL)稳定性2年，4°C保存。瓶5:药片（65粒）-含有PVPP稳定性5年，室温保存。试剂制备:1.备用试剂盒中的瓶1溶液随时使用。每个试验用量1.5mL，也可以同等量的蒸馏水稀释，然后每个试验用3mL。2.备用试剂盒中的瓶2随时使用。保存于-20°C下稳定性2年。3.准备瓶3中的溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。4.备用试剂盒中的瓶4溶液随时使用。使用前恢复到室温，每个试验用量20uL5.准备瓶5溶液随时使用。注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使用L-苹果酸标准质控溶液进行测定，通过提供的公式计算L-苹果酸的浓度。实验需要的设备:1.检测仪中提供有特定的测试用试管(平底;16x100mm)，同时我们也提供提取用试管(cat.no.G-MQTB25)2.10mL聚丙烯试管3.微量移液器(20uL).4.连续分配器5.玻璃刻度移液管及吸球6.MegaQuantTM测定仪7.定时钟注意:1.此方法是专门用于测定经过苹果乳酸发酵的葡萄酒，如果葡萄酒中的L-苹果酸浓度0.75g/L，需要对样品进行稀释。2.稀释葡萄酒或葡萄汁必须使用纯净水（蒸馏水或高质量的水），如果使用饮用水，首先需要用D-果糖标准品验证是否适合使用。3.测试用试管使用前必须清洗干净并烘干。操作步骤:去除酚醛树脂:(对于红酒通常需要进行处理)1.取5mL红葡萄酒加入到10mL的聚丙烯试管中2.加入1片PVPP药片（瓶5），拧紧试管盖，充分混合5分钟，用WhatmanNo.1(9cm)滤纸过滤，收集大约1mL的滤液，滤液的颜色不能深于浅粉色（一般处理法），然而，具有深颜色的葡萄酒每5mL需要加入2片PVPP，充分挤压收集滤液1mL。3.取20uL滤液进行测定A.测试方法A.(简单法–参照图1)1.取1.5mL溶液1(~23°C或更高)和1.5mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂配置方法第1点）。2.用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。3.加入20uL葡萄酒样品[经PVPP处理的(未稀释的红/白葡萄酒),未经PVPP处理的(未稀释的白葡萄酒)或经稀释的葡萄酒或葡萄汁]，充分振荡混合。4.大约1分钟后，将试管插入到MegaQuantTM测定仪，按下开关直到屏幕上显示‘---’（大约2秒钟）。5.当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A1）6.取下试管，加入20uL瓶3溶液（L-苹果酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。7.再次将试管插入MegaQuantTM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示‘1second’,记录下数值A2。8.为了确保试剂完全反应完全，在5分钟内每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值不再变化。（参考图1和图2）注意:1.如果数值A21.00，10倍以上稀释样品，并再次测定，如果数值A20.10，样品不要进行过分稀释（将100倍稀释改为10倍稀释）。2.由于INT对光有敏感性（显色剂在药片中），长时间的反应将导致溶液颜色加深，因此必须按照推荐的操作方法进行测定。3.在进行试验前，瓶1提前从冰箱中取出，并恢复到室温，如果温度23°C，反应过程将很快结束。4.添加药片到1.5mL溶液1和1.52mL蒸馏水中，确保药片全部溶解后测定的0吸光度值作为空白对照，然后加入20uL的L-苹果酸脱氢酶（瓶3），5分钟后测定增加的吸光度值(A2)，微小的吸光度变化(A2)是没有意义的（如由0.00到0.01）。计算:ΔAL-苹果酸=增加的吸光度值(A2)按照常规ΔAL-苹果酸的数值至少要在0.10个吸光单位，才能获得满意的试验结果。L-苹果酸的含量可以依照下列公式计算（参照图3中的标准曲线）:未经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c=0.771xL-苹果酸[g/L]20uL经稀释的样品c=0.771x稀释系数xΔAL-苹果酸[g/L]经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c=0.771xΔAL-苹果酸x102/100[g/L]=0.786xL-苹果酸[g/L]20uL经稀释的样品c=0.786x稀释系数xL-苹果酸[g/L]注释:102/100=经PVPP处理的葡萄酒的容差图1.用分光光度仪测定(25°C,1cm管径)的MegaQuantTML-苹果酸随时间的变化。注意:用此方法测定的L-苹果酸浓度比图3中测定的浓度要低，是由于此方法中使用的测试管管径为1cm，而MegaQuantTM测试管大约为1.3cm.测试方法B(对“缓慢反应”的处理)1.取1.5mL溶液1(~23°C或更高)和1.5mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂配置方法第1点）。2.用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。3.加入20uL葡萄酒样品经PVPP处理的红葡萄酒，充分振荡混合。4.大约1分钟后，将试管插入到MegaQuantTM测定仪，按下开关直到屏幕上显示‘---’（大约2秒钟）。5.当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A0），同时记录时间。6.取下试管5分钟，再次插入试管按下开关直到屏幕上显示‘1second’，插入试管前不要按压按钮，否则将导致测定仪读取错误,记录下数值A1（经过5分钟由于存在缓慢反应将导致颜色增深）。7.取下试管，立即加入20uL瓶3溶液（L-苹果酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。8.再次将试管插入MegaQuantTM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示吸光度,记录下数值A2。9.为了确保试剂完全反应完全，在5分钟内每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值变化不超过0.01个吸光单位。（参考图1和图2）计算:ΔAL-苹果酸=[(A2-A1)-(A1-A0)]由于A0数值为0，因此可以简化为：ΔAL-苹果酸=A2-(2xA1)例如（参照图1）:A2=0.42；A1=0.02ΔAL-苹果酸=0.42-(2x0.02)=0.42-0.04=0.38按照常规ΔAL-苹果酸的数值至少要在0.100个吸光单位，才能获得满意的试验结果。L-苹果酸的含量可以依照下列公式计算（参照图3中的标准曲线）:经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c=0.771xΔAL-苹果酸x102/100[g/L]=0.786xL-苹果酸[g/L]20uL经稀释的样品c=0.786x稀释系数xL-苹果酸[g/L]注释:102/100=经PVPP处理的葡萄酒的容差图2.用分光光度仪测定(25°C,1cm管径,492nm)的MegaQuantTML-苹果酸随时间的变化。测试样品为用PVPP处理并过滤的不同浓度的红葡萄酒（0-18ug），加入样品后测得A0，经过5分钟反应测定吸光度A1，可计算出“缓慢反应”比率，然后加入L-苹果酸脱氢酶（20uL）继续反应10分钟[5分钟后测定吸光度值A2]，如果使用MegaQuantTM测试仪进行测定，A0的吸光度值为0。制备样品:稀释样品.比色杯中（如：分析20uL的样品）的L-苹果酸含量必须在1.54-15ug之间，因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.007-0.75g/L之间。估计L-苹果酸浓度(g/L)蒸馏水稀释稀释系数F0.750.75-7.57.5-75不用稀释1+91+99110100样品处理事例:(a)测定葡萄汁和白葡萄酒中的L-苹果酸含量测定白葡萄酒和葡萄汁中的L-苹果酸含量，样品通常不需要处理，可直接进行测定。如有必要可以进行稀释。样品处理事例:(b)测定红葡萄酒中的L-苹果酸含量取5mL红葡萄酒加入到10mL的聚丙烯试管中，加入1片PVPP药片（瓶5），拧紧试管盖，充分混