【大学课件】常用生物化学检验技术

1常用生物化学检验技术※光谱分析技术※电化学技术※电泳技术※层析技术※离心技术※自动生化分析技术2光谱分析概念：利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量的分析方法3发射光谱火焰光度法、原子发射光谱法、荧光光谱法吸收光谱紫外、可见光、红外光及原子吸收分光光度法散光光谱比浊法光谱分析技术4568分光光度技术的基本原理透光度与吸光度T=I/IOT%=T×100%A=-lgT=-lgI/IO=lgIO/I9Lambert-Beer定律A=KLC适用用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体ε（摩尔吸光系数）：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时波长下的吸光度值10分光光度计的基本结构光源单色器比色杯检测器显示器11光源光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，有足够强度和稳定性可见光分光光度计——钨灯紫外光光度计——氢灯12单色器将光源的复合光分散为单色光的装置滤光片棱镜光栅13比色杯玻璃或石英光径为0.1~10cm,一般为1cm校准14检测器光信号转为电信号光电管及光电倍增管15显示器检流计、微安表、记录器透光度和吸光度数字显示器透光度和吸光度和浓度16操作方法开关——打开比色池盖子——20分钟预热选定预定波长空白、校准或待测液放入比色池，空白置于光路中开光于T位，打开比色池盖子，粗、细调T为0.0关上比色盖子，调T为100.0开关于A，用消光调零重复步骤4和5将校准或待测液光路中测A17分光光度技术的定量方法标准曲线法条件变应重新绘制标准品纯且准待测液吸光度超过线性范围，应稀释再测待测液与标准曲线条件相同比较法CU=(AU×CS)/AS18火焰光度法(原子发射光谱)原理标本原子（基态）→激发态→释放光能→不同原子有不同特征光谱线→浓度与发射光强度成正比钠的特征谱线为589nm钾的特征谱线为767nm19202122溶液中带电粒子在直流电场中向电性相反电极移动的现象称为电泳。电泳23利用带电粒子在电场作用下定向移动的特性，对混合物组分进行分离、纯化和测定的技术称为电泳技术。电泳技术24COO-HCNH3+RCOO-HCNH2RCOOHHCNH3+RH+H+OH-OH-pH=pIpHpIpHpI原理人血清蛋白的等电点和电泳迁移率蛋白质等电点电泳迁移率cm2.s-1.v-1白蛋白4.845.9×10-5球蛋白5.065.1×10-5球蛋白5.064.1×10-5球蛋白5.122.8×10-5球蛋白6.85~7.301.0×10-526电泳迁移率是带电粒子在单位电场强度作用下的移动速度。即反映带电粒子在每厘米降为1伏特（V/cm）的电场强度下每秒钟内移动的厘米数（cm/s）。27µ=V/E=(1/t)/E=1/tE=cm2/V.sµ为电泳迁移率，V为粒子移动的速度（cm/s），即1/tE为电场强度（V/cm）T为时间（秒）1为移动的距离（cm）µ为蛋白质电泳的特征常数µ的单位为cm·s·v28电泳速度（V）与其电量（Q）和电场强度成正比，而与粒子的半径（r）和介质粘度系数（η）成反比，即V=QE/6πrη这样µ=V/E=Q/6πrη根据Stoke定律291、根据被分离的样品多少分为分析电泳制备电泳2、根据电泳时电压的高低分为高压电泳（50V/cm以上）常压电泳（50V/cm以下）电泳的分类303、根据电泳媒介的不同分为自由电泳（溶液）区带电泳（支持介质）4、根据电泳系统是否均一分为连续电泳不连续电泳31影响电泳的因素1、分子的形状和性质2、电场强度电场强度大，速度快，产热多，变性；电场强度小，速度慢，产热少，区带模糊32组成成分pHpH与pI比较，4.5-9.0,正极pH负极离子强度离子强度越大，缓冲容量越大，pH越稳定，电泳速度越慢，标本扩散，产热多，蒸发快；0.05-0.1mol/L3、缓冲液335、蒸发作用6、样品4、支持物吸附作用电渗作用34电泳仪由直流电源和电泳槽两部分组成。一、直流电源一般由交流电经过整流获得恒压电源恒流电源恒功电源35二、电泳槽盖电极及电极室支架36373839常用的区带电泳滤纸电泳（PE已淘汰）醋酸纤维薄膜电泳（CAE）琼脂糖凝胶电泳（AGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）404142电泳区带的测定区带染色溴酚蓝、丽春红（蛋白质）PMS-NBT系统（同工酶）苏丹红、苏丹黑（血浆脂蛋白）溴化乙啶（核酸）43区带定量光密度扫描法洗脱比色法44SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳4546484950不同的蛋白质具有不同的等电点，利用具有线性pH梯度的电泳介质来分离等电点不同的蛋白质，这种电泳技术称为等电聚焦电泳。51进行等电聚焦电泳的条件1.有一个在电泳条件下基本稳定的、重复性良好的pH梯度。2.有一个抗对流的电泳材料。3.电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带。52双向电泳是先把样品从一个方向进行电泳分离，接着再与其成90°方向进行第二次电泳分离。第一次电泳以其电荷性质为基础；第二次电泳则按分子量不同进行分离。53转移电泳是将凝胶电泳的高分辩率与放射标记或酶标记等免疫化学方法的高灵敏度结合起来的电泳技术。545556571.用凝胶电泳分离蛋白质或核酸2.用电泳的方法将已分离的蛋白质或核酸转移到硝酸纤维膜或重氮苄氨基甲基纸上。3.鉴定纸上的蛋白质或核酸其方法步骤58层析技术利用混合物中各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、极性、亲和力、分配系数等）的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相，从而以不同速度移动而分离。59纸层析比移值（Rf）=溶质谱带中心移动距离/流动相前沿移动的距离60凝胶层析61