CCK8实验

CCK-8实验实验原理CCK8全称CellCountingKit-8试剂，可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。该试剂主要用途有：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验实验步骤实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：将需要测量的细胞收集后离心，并使用新鲜配液重悬、计数；2、接种到96孔板中根据合适的铺板细胞数，每孔约100μl细胞悬液，同样的样本最好做3个及以上复孔；3、37℃培养箱中培养将接种好的细胞放入细胞37℃培养箱中培养2-4小时使细胞贴壁，如果细胞为悬浮细胞，则这一步可以省去。4、加入10μlCCK8每孔加入10μl的CCK8试剂，由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。5、培养1-4小时细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。实验二：细胞毒性分析-1-1、制备细胞悬液将需要测量的细胞收集后离心，并使用新鲜配液重悬、计数；2、接种到96孔板中根据合适的铺板细胞数，每孔约100μl细胞悬液，同样的样本最好做3个及以上复孔；3、37℃培养箱中培养将接种好的细胞放入细胞37℃培养箱中培养2-4小时使细胞贴壁，如果细胞为悬浮细胞，则这一步可以省去。4、加入不同浓度的毒性物质5、37℃培养箱中培养加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。6、加入10μlCCK8每孔加入10μl的CCK8试剂，由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。7、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。若暂时无法及时测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。注意事项1、当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μl培养基)。酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避-2--3-免细菌污染，以免影响结果。2、CCK8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。3、当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。4、在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度作为空白对照。5、金属对CCK8显色有影响：当终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。