02 分子克隆工具酶

第2章分子克隆工具酶在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术。在体外对DNA进行分离纯化、连接重组或者修饰合成等，都会涉及一系列酶促反应。用于基因工程的工具酶种类繁多(表2.1)、根据其功能可粗略分为限制酶、连接酶、聚合酶和修饰酶4类。表2.1常用工具酶与基因克隆技术工具酶类主要用途限制性核酸内切酶切割DNA分子形成片段DNA连接酶DNA片段的连接重组大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ切口平移法标记DNA探针T7DNA聚合酶DNA序列测定分析TaqDNA聚合酶PCR体外扩增技术多核苷酸激酶末端标记法制备探针S1核酸酶去除双链DNA的局部单链2.1限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能；限制酶的分类与命名；Ⅱ型限制酶的特性与DNA切割；影响限制性核酸内切酶活性的因素；2.2DNA连接酶基本性质；连接作用；影响连接反应的因素；2.3DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶；Klenowfragment；T7DNA聚合酶；T4DNA聚合酶；修饰过的T7DNA聚合酶；逆转录酶；2.4核酸修饰酶核酸酶；碱性磷酸单酯酶；T4多核苷酸激酶；末端转移酶。2.5甲基化酶主要教学内容掌握限制酶和连接酶的性质与功能；了解聚合酶和修饰酶在基因操作中的用途。重点与难点限制酶的分类；常用限制酶的性质；影响连接反应的因素；聚合酶的分类与性质。教学目标与要求教学要求需掌握专业词汇限制与修饰；星号活性；偏爱现象；Klenow片段；Reversetranscriptase，同裂酶与同尾酶。核酸酶是通过切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键，导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶，可分为核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)。按其水解断裂核酸分子的不同方式：核酸外切酶(exonuclease):从核酸末端顺次水解磷酸二酯键核酸内切酶(endonuclease)：内部磷酸二酯键2.1限制性核酸内切酶寄主控制的限制(restriction)与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。λ噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其他宿主时会受到限制。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解。2.1.1限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制与修饰现象图解Arber限制修饰酶1968年，MeselsonandYuan从E.coli菌株Ｋ和Ｂ中发现了Ⅰ型限制酶；1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindⅠ和HindⅢ限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。限制（Restriction）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基。修饰（Modification）2.1.2限制酶的分类与命名限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶。三种类型限制酶的主要特性差异比较距识别序列下游24-26bp处识别序列内或附近特异性切割距识别序列1kb处随机性切割切割位点GAGCCCAGCAG旋转对称序列TGAN8TGCTAACN6GTGC识别序列ATP、Mg2+、SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM（S-腺苷甲硫氨酸）辅助因子异源二聚体同源二聚体异源三聚体蛋白结构双功能单功能多功能限制修饰Ⅲ型Ⅱ型I型主要特性I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶4种活性。显著特点：识别位点与切割位点不一致。酶分子首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。代表：EcoB和EcoK。I型限制性内切酶识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷甲硫氨酸)。作用机理在距离特异性识别位点约1000～1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb切割位点有核酸内切酶和甲基化酶作用。酶分子由两个亚基组成。M亚基负责位点识别与修饰，R亚基具有核酸酶活性。在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAGⅢ类限制性内切酶1970年，由H.O.Smith和K.W.Wilcox从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ。限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同酶分子组成，分子量小，能识别DNA的特殊序列，种类多，在基因工程中起重要作用。Ⅱ型限制性内切酶能识别双链DNA的特殊序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。其种类繁多。通常所指的DNA限制性核酸内切酶。在基因工程技术中，I型不能用，Ⅲ型酶基本不用，Ⅱ型酶最有用。限制酶的命名1973年Smith和Nathams提出限制酶的命名原则，1980年Roberts对其系统化，如今简化成：HindⅢ，来源菌株Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株HindⅢ微生物属名种名株名(品系)发现序数识别双链DNA分子中4～8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点2.1.3Ⅱ型限制酶的特性与DNA切割(1)基本特性大多为回文序列5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI等产生的5’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3’…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPstI等产生的3’粘性末端①连接便利不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。粘性末端的意义③补平成平齐末端凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ37℃5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’PvuⅡ等产生的平头末端常用的限制酶及其识别序列和切割位点名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割位点BamHⅠG↓GATCCPstⅠCTGCA↓GClaⅠAT↓CGATSalⅠG↓TCGACEcoRⅠG↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅢA↓AGCTTSfiⅠGGCCNNNN↓NGGCCHindⅡCTPy↓PuACSmaⅠCCC↓GGGKpnⅠGGTAC↓CXbaⅠT↓CTAGANotⅠGC↓GGCCGCXhoⅠC↓TCGAG同裂酶（Isoschizomers)识别位点的序列相同的限制性内切酶。完全同裂酶识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’(2)同裂酶与同尾酶XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。不完全同裂酶识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。同尾酶(Isocaudamers）5’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A限制酶识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特异性，对不同的DNA普遍适用。识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率，可从理论上推导酶切DNA片段的大小。(3)Ⅱ型限制酶的识别序列与DNA的切割限制酶识别序列的相邻序列（长度要求）效应。大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸也不具催化活性的。限制酶的偏爱现象。限制酶对识别序列两侧的核苷酸的组成有关。（对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率）限制酶的星星活性。指某些限制酶在不适的环境中其识别序列发生改变（切割与识别序列相似的序列）的现象。(1)底物DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。①加大酶的用量（1个酶单位指在建议使用的缓冲液及温度下，在20μl反应液中反应1h，使1μgDNA完全消化所需的酶量。）②加大反应总体积（稀释），③延长反应时间2.1.4影响限制性核酸内切酶活性的因素（酶切反应条件）当DNA样品确定后，为完全切割此DNA，酶的用量视酶的催化活性而定。酶活力单位：在最佳反应条件下反应1h，完全水解1mg标准λDNA所需的酶量定为1U。容积活性：1ul酶溶液中具有的酶活力单位。DNA所需酶量来换算。酶用量修饰体系组成部分，强烈影响酶的活性。大肠杆菌中的dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基。受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI。不受影响E.coli的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基。受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5’CG3’序列中的C5位上引入甲基。(2)DNA样品的甲基化程度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37℃，少数要求40℃～65℃。酶最适温度℃酶最适温度℃ApaIBclIMaeIITaqIApyI3050506530BstEIIMaeIIIBanIMaeISmaI6055504525(3)酶切消化反应的温度缓冲液组分包括：氯化镁、氯化钠或氯化钾、β-巯基乙醇或DTT、BSA、Tris-HCl等。高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些限制酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。每种酶只有在最适的反应缓冲液中才具有