3-第二章 生物大分子(2 RNA)

二、RNA1.RNA的种类2.RNA的结构3RNA的进化4.RNA的功能5.RNA的提取1.RNA的种类•rRNA:占80-85%•tRNA•非编码RNA（ncRNA）•mRNA:占1-5%占15-20%•rRNA:3~4种•tRNA：约50种•mRNA：在1000种以上.原核生物与真核生物核糖体成分的比较1.RNA的结构含有尿嘧啶、核糖的单链RNA的一级结构：核苷酸的排列顺序hairpinbulgeloopPseudoknots（假结）RNA分子的二级结构碱基配对RNA内部的非Watson-Crick碱基对G:U是另外的常见配对，增强了RNA自我互补配对的能力。RNA链自身折叠形成的局部双螺旋类似A型DNA。Figure6-33G:UbasepairRNA的二级结构非典型的碱基配对RNA的三级结构：空间构象•由于RNA没有形成长的规则螺旋的限制，因此可以形成大量的三级结构。•对RNA三维结构的认识主要来自于对tRNA的研究，因为获得分子量较大的RNA的结晶较为困难。X-射线晶体学研究显示，细胞中的tRNA是以L-形的三维结构存在的（酵母的丙氨酰tRNA76nt），tRNA在溶液中的构型与其晶体结构一致。1965年完成测序1968年诺贝尔奖1974年大肠杆菌核糖体的典型三维结构，电镜、X射线晶体学、生化方法的结合大肠杆菌70S核糖体的三维结构莱马克里斯南施泰茨尤纳斯2009年诺贝尔化学奖得主3.关于RNA的进化•RNA作为原始分子的概念则是1968年Crick和Orgel，1967年Woese分别提出的。•1972年和1993年，Noller等提供了一系列的证据说明核糖体RNA比核糖体蛋白在核糖体的功能中更加重要，为早期的推测提供了实验证据。•1982年和1983年，RNA催化功能的发现为RNA世界合理性的构筑提供了更加坚实的基础。•RNA世界(RNAworld)是Gilbert在1986年提出的，其主要兴趣在于催化性的RNA是怎么产生了基因的外显子-内含子结构的。(A)RNAfunctionedasbothacarrierofinformationandanenzyme.(B)RNAcatalyzedthesynthesisofproteins,andtheseproteinscatalyzedthetransitionfromRNAtoDNA.(C)ProteinsandRNPscatalyzethereplicationofDNA.生物大分子进化中的地位•RNA世界经历了三个阶段：（1）原始的RNA世界40亿年前，RNA分子具有双重作用，既是信息分子也是生物催化剂，构成了一个自我复制的系统，与其他的核酶一起催化复杂的代谢，并构成了独立的早期生命形式。（2）当今的RNA：偶尔独自发挥作用，例如：核酶、核糖开关；多数情况下，与蛋白质协同起作用，例如：核糖体和剪接体中的RNA组分保留了催化活性，在端粒酶和信号识别颗粒中，起催化作用的则是蛋白质；RNAi机制中，RNA的作用则减少到一个简单的引导序列这一功能。（3）RNA技术的应用虽诞生仅半个世纪，但是一个充满活力的领域。例如：利用适配体（aptamers）检测人体血清中多种蛋白的浓度在临床上有应用价值；miRNA和反义核酸（抑制miRNA）具有制药潜力，成为众多制药公司研发的内容之一。4RNA的功能信使功能：催化功能：调控功能：mRNA是遗传信息传递的中介分子。RNA也可以作为一些病毒的遗传物质，这些病毒的基因组可以自我复制或者通过DNA中介进行复制。（1）信使功能RNA涉及多种生物学过程（2）催化功能•1982,ThomasCech发现Tetrahymenathermophila的26SrRNA的单个内含子在体外具有自我剪接的能力。•1983,SidneyAltman发现Escherichiacoli的RNaseP中的RNA组分在体外，能够在没有其蛋白质亚基的条件下进行tRNA前体的加工。•1989,Cech和Altman因此获得诺贝尔化学奖。切赫(ThomasRobertCech)美国斯坦福大学医学院资源网址:年诺贝尔化学奖奥尔特曼(SidneyAltman)美国耶鲁大学资源网址:(pre-rRNA)(A)电镜观察17S和26SrRNA与rDNA的杂交结果(B)同位素标记26S前体RNA在体外以SP6RNA聚合酶进行转录。0：未进一步孵育-：在30℃孵育75min，不加GTP+：在30℃孵育75min，加GTPP为前体RNA,E为连接起来的外显子，C、L和N为剪接下来的不同形式的内含子RNaseP可以催化tRNA的成熟(A)tRNA分子的5’前导序列的剪接由RNaseP催化（B)人类RNaseP的重组内切活性的检测，说明RNaseP的蛋白亚基对其催化活性是必须的，单独的H1RNA无法将前导序列从tRNA上移去。S为未切割底物tRNATyr，Ctrl为纯化的人类RNaseP的对照，Rpp是蛋白亚基RNP参与的过程功能组成RNA组分的作用端粒酶DNA复制线性染色体末端复制端粒RNA+蛋白（反转录酶）反转录的模板剪接体RNA加工前体mRNA内含子的移除snRNAs+~200种蛋白U6和U2snRNA催化剪接RNA酶PRNA加工成熟tRNA的5‘端的形成H1RNA+~10种蛋白（人类）催化性的RNP核糖体翻译蛋白质合成机器4种rRNA+50种以上蛋白质23SrRNA催化肽键的形成信号识别颗粒（SRP）蛋白的定向介导蛋白定向到内质网膜上7SRNA+6种蛋白质RNA是组织蛋白结合的支架RNP参与多种生物学过程一些RNA可以直接控制基因表达，调控途径多样，包括不同的RNA折叠，核糖开关，与非编码RNA有关的RNA干扰现象、X染色体随机失活现象等。(3)调控功能①RNA的不同折叠:细菌中的色氨酸操纵子是典型例子。大肠杆菌中色氨酸操纵子的转录衰减由RNA折叠的变化介导的抑制，转录衰减效应可以达到10倍。抗终止终止终止子发夹形成抗终止子发夹形成细胞内色氨酸充足时，核糖体不会在TrpL上串联的Trp密码子处停留，迅速到达TrpL的终止密码。衰减：细胞内的色氨酸不足时，核糖体停滞在TrpL上串联的Trp密码子处停留，形成抗终止发夹，结构基因trpEDCBA的转录发生。由蛋白质介导的抑制与RNA折叠的变化介导的抑制方式并存时，色氨酸操纵子结构基因的转录水平可以改变600倍。在缺乏色氨酸时，编码色氨酸生物合成的酶正常转录翻译。细胞内色氨酸充足的时候，与二聚体化的色氨酸抑制蛋白结合，诱导其构象的变化，使抑制蛋白和操纵子结合，阻碍了RNA聚合酶靠近启动子。②核糖开关（Riboswitches）RNA可以与小分子结合，例如:鸟嘌呤、赖氨酸等，从而改变RNA的结构，是细菌中普遍存在的基因表达的调控方式，该现象在植物中也有发现。•一些mRNAs分子中的特定结构域选择性的结合一些代谢物，作为可以调节的“开-关”元件，在不需要蛋白转录因子的条件下就能够控制基因的表达，称为核糖开关。因此，RNA在功能上就可以作为不同信号的感受器，感受温度、盐浓度、离子、氨基酸和其他小分子有机代谢物的变化。•核糖开关的典型位置是在mRNAs分子的5’非翻译区（5‘-untranslatedregions，5’-UTR）。•在结构上，绝大部分的核糖开关可以粗略分成两个结构域：适配体（aptamer）:与靶代谢物选择性结合的RNA序列，长度在100nt以内。表达平台（“expressionplatform”）:在代谢物结合时，通过改变RNA的折叠形式，影响基因表达。核糖开关的作用机制左侧：转录水平的调控涉及到代谢物的结合，特定构象适配体的稳定，进一步形成终止子发夹，阻止全长mRNA的转录。右侧：翻译水平的调控则是通过代谢物或温度诱导的结构变化，阻止核糖体和mRNA的结合。•核糖开关的作用机制：通过对小分子的浓度改变进行应答，来调控基因的表达，这一调控是通过改变RNA的二级结构来完成的。2004年发现具有催化活性的RNA参与了遗传调控。例如：glmS对添加的GlcN6P应答，进而切割自身mRNA。GlmS是6-磷酸葡糖胺（GlcN6P）合成相关的酶，由glmSmRNA编码，其中含有核酶序列。在有GlcN6P时，核酶切割自身的mRNA，阻止进一步的生成GlcN6P。③RNA干扰：不仅涉及mRNA水平的事件，也调节染色质的结构。实际上，在染色体着丝粒区高度异染色质化的维持依赖RNAi的活性。④X染色体随机失活大分子量的ncRNA常常在合成它们的染色体位点上起作用，通过吸引蛋白对染色质进行修饰，关闭基因表达，这种效应可以扩展到整条染色体，例如：XistRNA将整条X染色体凝集，产生基因剂量补偿（genedosagecompensation）。RNA的生物学功能1.RNA是一些病毒的遗传物质。2.与蛋白质合成有关，mRNA在功能上是基因和蛋白合成机器之间的中介；tRNA在功能上是mRNA上密码子和氨基酸之间的衔接分子。3.有些RNA具有催化活性（核酶）。4.RNA可以通过多种途径调节基因表达。5.RNA的提取•提取原则：一般分子量较小，不易被机械拉力打断；最重要的是抑制RNA酶（RNase）的活性，防止RNA被降解。•RNase的特点：该酶的稳定性极高，活性也不依赖二价阳离子，可以耐受多种处理（煮沸、酸、碱等）而不失活。存在广泛，环境中的灰尘、实验器皿、试剂以及人的汗液、唾液中均存在。•RNA操作的要点——创造一个无RNA酶的环境！（1）防止外源RNase污染:•洁净实验室环境一次性手套，勤换；操作时可以带口罩。环境洁净（避免飞尘中细菌、真菌产生外源性RNA酶污染，无空气对流）•玻璃和塑料器皿处理玻璃：常规洗净后，200℃干烤4小时塑料器皿（离心管、枪头等）：用0.1%的DEPC水常温浸泡过夜，灭菌干燥后使用。•溶液配制：加0.1%DEPC处理的双蒸水配制，高压除去残留的DEPC。DEPC的特点和使用•DEPC（焦碳酸二乙酯）是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活性。•DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤，不小心占到手上注意立即冲洗。。•DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩。•高压蒸汽灭菌121℃，25min后，DEPC分解成二氧化碳和酒精。（2）抑制内源的RNase的活性：常用的抑制RNase的试剂有：异硫氰酸胍：强烈变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，使RNA从细胞中释放。β-巯基乙醇和异硫氰酸胍能使细胞内各种RNA酶失活。十二烷基肌酸钠：使核糖体蛋白质与RNA分离。RNasin：RNA酶的一种非竞争性抑制剂，反转录实验常用。•RNA的保存：实际操作中，RNA提取并检验质量后，会马上进入下一阶段的实验，如：纯化mRNA、cDNA合成、Northernblot等，一般不会长期保存。温度：-20℃介质：0.1%DEPC水rRNA大小完整，而且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2：1，而且mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。RNA质量的鉴定RNA明显降解质量较好的总RNA思考题1.在进化中，RNA分子的地位有怎样的变化，为什么RNA可能是最早出现的生物大分子？2.简述RNA的功能。3.获得高质量RNA的操作应注意什么？