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79质谱技术在药物代谢和药物动力学中的应用药物代谢（PK）是指药物在生物体内吸收、分布、生物转化、排泄等一系列过程；药物动力学（ADME）则是对这一系列过程定量研究的学科。药物代谢的生物转化过程、包括药物分子功能团的增减、变换、分子的缩合、降解等。药物经生物转化后，其相应的理化性质亦发生变化，从而引起其药理及毒理活性的改变。药物代谢的研究，包括药物及其在各种复杂的样品基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中代谢物的分离、结构鉴定以及痕量分析测定。利用MS/MS和LC(GC)-MS/MS等联用技术，不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的分离纯化代谢物样品的工作，而且能分离鉴定以往难于辩识的痕量代谢物，从而迅速、方便地解决问题。因此，在探讨药物代谢特征、确定药物代谢物结构及代谢途径与药物及代谢物的药理作用及毒副作用间的关系，即结构—代谢—活性/毒性三者之间的相关性等药物代谢研究方面，色谱质谱联用技术已成为应用最广泛地分析平台。药物动力学的研究，需要在各种复杂的样品基质中定量测定痕量的药物或代谢产物。近几年，随着大量缓释、长效制剂的开发和复合给药的尝试，药动研究需要更灵敏的检测仪器来满足低检测线的测量，因此在国内外，色谱质谱联用技术也已成为药动分析最主要的检测方式。液质联用仪最常用的离子化技术为API（大气压电离源），属于“软电离”方式，包括ESI（电喷雾）、APCI（大气压化学电离）、APPI（大气压光电离）。这三种不同的电离方式对药物化合物分析覆盖面广，灵敏度高。目前还没有一个明确的规定判断何时使用某一种电离方式更好，但普遍认为：ESI源适合强极性和中性化合物，如一些带极性基团的化合物、小肽类和蛋白类化合物；APCI源适合弱极性，热稳定，分子量比较小的化合物；APPI更适合于共轨基团化合物的检测，如含苯环、萘环的化合物。LC/MS技术首先通过LC的分离，使MS可以分析具有大量杂质的混合物中的待测物，并提高分析的专一性和灵敏度，而且色谱无法分离的化合物，也可以进行检测鉴定。同时，如果使用MS/MS或MSn技术能得到更高的灵敏度，更多的代谢物结构信息。串接质谱和离子阱质谱，均可用于定性和定量，但二者的侧重点不同；串接质谱用于定量灵敏度更高，重现性更好，线性范围更宽；离子阱质谱用于定性，能获得更多的代谢物结构信息，扫描速度快的特点对复杂未知代谢物样品的定性，有其独特的优势。一，质谱技术在药物代谢中的应用检测原理和方法：由于多数药物的代谢物保留了原药分子的骨架结构或一些亚结构，因此，代谢物可能进行与原药相似的裂解，丢失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子。用串接的MS/MS分别进行中性丢失扫描、母离子扫描以及子离子扫描，即可迅速找到可能的代谢物，并鉴定出结构。利用MS/MS鉴定药物代谢物的方法，主要包括以下几个步骤：1.测定原药的质谱；2.测定原药的子离子谱，选择质子化分子离子、加合离子进行裂解；3.选择原药的主要中性丢失测定生物样品的中性丢失谱,图谱中的离子即为原药和可能的代谢物的分子离子；4.选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱，所得母离子即为各个代谢物；5.测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解谱得到代谢物的结构;6.测定代谢物的子离子谱，选择任一新出现的中性丢失和子离子重复进行步骤3。用离子阱质谱鉴定药物代谢物，主要包括如下几个步骤：1.直接进样测定原药的MSn子离子谱，选择分子离子和主要的碎片离子进行裂解；2.LC/MS联用测定代谢物的MSn子离子谱；3.使用数据相关性扫描功能一针进样得到MSn数据，数据相关性扫描功能可以与动态排除技术与masslist的排除列表相结合，提高扫描效率；4.如果3不能得到好的结果，可以预测可能的代谢物，在数据相关性扫描的masslist列表中填入预测代谢物的质荷比，测定MSn子离子谱；5.对原药和代谢物的断裂规律进行比较，确定代谢物，利用MSn数据确定可能代谢物结构。80最适高通量筛选平台有3D离子阱系列平台，线性离子阱及其高分辨质谱系列平台，ExactiveTM高分辨台式液质联用仪，和串联四极杆TSQQuantum系列平台。1，离子阱系列质谱仪3D和线性离子阱系列质谱仪通过多级质谱数据提供结构信息的功能准确可靠地鉴别未知化合物；快速正/负离子切换，在更短的时间内和更少量的样品条件下，完成更多种类化合物的分析，标准的规一化碰撞能量技术可生成重现性谱图以进行谱库的检索，其中线性离子阱系列质谱仪比3D离子阱系列质谱仪扫描速度更快。多种扫描方式和智能化分析软件使实验设计更优化。线性离子阱系列中的LTQ质谱仪可升级成LTQ-FT,LTQ-obitrap等其高分辨质谱系列平台，其高分辨率提供了超强的精确质量数测定，能更强地确认代谢物和其结构。图2.抗抑郁躁狂药奈法唑酮LTQ-ObitrapTM的二级全扫质谱图，使用MassFrontier解析碎片结构，判断断裂规律图1.数据相关性扫描流程图81离子阱的智能化分析功能为复杂样品分析提供更智能的自动化数据采集功能，其主要特点包括：1，数据关联采集技术™，只有在目标化合物被检测到时，才会启动多级质谱数据的采集；2，动态排除技术™，允许对离子强度较低的离子进行多级质谱数据采集；3,自动增益控制技术™(AGC)，对各种类型的扫描都能够保证离子阱中存有最适宜的离子数量；4,宽带激发技术™，碎裂MS/MS二级质谱中的水丢失离子，生成更具有结构信息特征的谱图；5,规一化碰撞能技术NCE™，消除离子阱二级质谱中的质量歧视，保证不同仪器之间数据的重复性6,脉冲Q点裂解技术(PQD)™，能够捕获低质量碎片离子,减少了三分之一效应。2，串联四极杆TSQQuantum系列质谱仪即有串联四极杆传统的子离子扫描，母离子扫描和中性丢失扫描，又结合了运用反相能量扫描功能的数据相关性扫描，反相能量扫描功能可使MS/MS谱图的碎片信息更丰富，提高了谱图质量和重现性。3，MetworksTM代谢物鉴定软件MetworksTM代谢软件能有效、可靠地分析XcalibarTM采集的数据，从而鉴定和确定代谢物，并结合了MassFrontierTM对化合物碎片断裂规则的预测功能。它应用相同保留时间下离子不同断裂碎片的质谱树技术，对空白数据和样品进行比较，得到可靠的分析结果。其主要工作原理：1，输入母药分子量和结构式，通过空白和样品的比较，找到不同的离子，根据m/z与母药m/z的差异，自动预测化合物是母药的那种代谢物，MassFrontierTM软件自动对这些离子自动预测其碎片，得到理论谱图；2，对理论谱图与MS/MS或MSn谱图进行比较数据匹配分析，结果中给出匹配率；3，将多种谱图整合在一个界面上，方便能快速察看结果。质量亏损原理有效地应用于代谢物的预测中，使结果更可靠，利用杂交质谱能测定精确分子量的功能能进一步为结构式信息提供依据。图4.使用MetworksTM代谢物分析；(a).MetworksTM7步流程.(b).MetworksTM代谢物测定结果显示界面图3.确定奈法唑酮代谢物的理论质量、测试质量和质量亏损82二，质谱技术在药物动力学中的应用药物动力学实验主要侧重于复杂基质中药物的定量问题。复杂基质引起的基质效应是定量中的难题。以下几个功能为解决基质效应的有效方法：A，H-SRM（高选择性选择反应扫描）扫描功能，TSQQuantum系列质谱仪的H-SRM扫描功能，可调低Q1的FWHM,从而减少噪音在Q1的通量，提高信噪比，从而提高检测灵敏度。B，FAIMS(电场不对称离子运动离子源)接口，根据高低电场来改变共流出离子的运动状态，较少化学噪音和蛋白干扰。高低电场内的CV电压是化合物依赖性参数，因此可提高检测的灵敏度。C，TurboFlow技术，分析柱前需要TurboFlow柱，可直接将离心后的生物样品上样，TurboFlow柱洗脱蛋白，再将保留在TurboFlow柱上的小分子化合物洗脱到分析柱分析，有效改善基质效应，并明显减少前处理时间。1，串联四极杆TSQQuantum系列质谱仪可监测上百对SRM，2ms切换时间、零交叉污染碰撞池的专利设计，QED功能可在SRM扫描中自动触发反相能量扫描的MS/MS数据采集；图5尿液中去甲维拉帕米在LC-SRM、LC-HSRM、LC-FAIMS-SRM和LC-FAIMS-HSRM四个条件下的灵敏度比较832，线性离子阱系列质谱仪克服了传统离子阱定量稳定性差的遗憾，同时保留了比传统离子阱更高的扫描速度和灵敏度。能进行MSn定量，可提高灵敏度。其定量范围和定量稳定性比传统3D离子阱更有优势。3，TurboFlow技术高通量快速筛选药物在医药研究领域中，由于大量药物是极性较大的化合物，仅有约20%的药物可用GC分析，其中多数还必须经过衍生化步骤，因此局限性很大。LC可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物(包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤。因此液质联用长期为人们所关注。列举中国部分客户文章摘要：1，人尿中苯丙哌林羟基化代谢产物的研究；杜宗敏黄海华陈笑艳钟大放；《药学学报》2000-35卷-12期-916-920摘要:目的　研究苯丙哌林在人体内的羟基化代谢过程。方法　选择10名健康男性受试者单剂量口服60mg苯丙哌林，收集0～24h尿样，经固相萃取后用LC/MSn法检测羟基化代谢产物。利用微生物转化法和半制备HPLC获得其中两种代谢产物的对照品，并经NMR鉴定结构。根据质谱断裂规律进一步推测结合型代谢物的结构。结果在人尿中发现苯丙哌林的5种羟基化代谢产物和它们与内源性葡糖醛酸和硫酸的结合物，与代谢物对照品的液相色谱和质谱信息比较，确证了其中两种代谢产物的结构分别为4″-羟基苯丙哌林和4″-羟基苯丙哌林。结论　苯丙哌林的羟基化代谢优先发生在芳环烷氧基对位，5种羟图6.测定醚苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆三种化合物结果表明TSQQuantum零交叉污染。基线放大6000倍图7LXQ测定唾液中苯甲酰牙子碱的校正曲线84基化代谢产物在尿中主要以葡糖苷酸或硫酸酯结合物形式存在。2，液相色谱-质谱联用法鉴定必特螺旋霉素中多组分；史向国钟大放；《质谱学报》2003-24卷-4期-460-463摘要:采用KromasilC18色谱柱(5μm粒径，200×4．6mm内径)，流动相为乙腈-10mmol／L乙酸铵溶液(V(乙腈)：V(乙酸铵)=60：45)，建立快速分析抗生素新药必特螺旋霉素中复杂多组分的分析方法。采用电喷雾离子化源，以正离子检测方式进行一级、二级全扫描质谱分析。研究表明：其中含有10种螺旋霉素类衍生物并推断出化学结构，通过与对照品的色谱和质谱行为对比得到验证。采用液相色谱一质谱联用技术(LCMS)可以快速阐明复杂多组分抗生素新药必特螺旋霉素类的化学组成，并且可以作为一种简单、便捷的分析方法对大环内酯类新抗生素进行高通量筛选。应用文献：1，应用FinniganTSQQuantumDiscovery质谱仪增强质量分辨率来提高分析的灵敏度..............................................................................................................852，应用FinniganLTQ线性离子阱质谱仪测定胆碱及其代谢物.........................................................................................................................................................893，应用FinniganLCQDecaXPPlus离子阱质谱仪和LC-MS/MS方法检测马血浆中的乙酰胆碱及其主要代谢物...................................................................954，Sensitivityand