第9章 酶促反应动力学

第9章酶促反应动力学KineticsofEnzyme—CatalyzedReactionsOUTLINEBasicofchemicalKineticsSubstrateconcentrationeffectonthecatalysisrateTheinhibitionofenzymaticactivityTheeffectoftemperatureTheeffectofpHTheeffectofactivatorKineticsofEnzyme—CatalyzedReactions是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学意义：1）研究酶的结构与功能的关系及作用机制。2）发挥酶催化反应的高效率,寻找最有利的反应条件。3）了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制。KineticsofEnzyme—CatalyzedReactions9.1化学动力学基础BasicofchemicalKinetics两个基本问题：反应进行的方向、可能性和限度反应进行的速率和反应机制前者属于化学热力学的研究范围，后者属于化学动力学研究范围。9.1.1反应速率及其测定反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。用瞬时速率表示反应速率：dcv=-——（反应物浓度的减小）dtdcorv=+——（生成物浓度的增加）dt化学动力学基础9.1.2反应分子数和反应级数9.1.2.1反应分子数反应分子数是在反应中真正相互作用的分子数目。单分子反应,速率方程式：dcv=-——=kcdt双分子反应的速率方程式：dcv=-——=kc′c″dt化学动力学基础9.1.2.2反应级数根据实验结果，整个化学反应的速率服从哪种分子反应的速率方程式，则这个反应即为几级反应。反应分子数和反应级数这两种分类方法对很简单的反应来说是一致的。化学动力学基础9.1.2.3各级反应的特征1.一级反应凡是反应速率只与反应物的浓度的一次方呈正比的，为一级反应。2.二级反应凡是反应速率与反应物的浓度的二次方（或两种物质浓度的乘积）呈正比的，为二级反应。3.零级反应凡是反应速率与反应物的浓度无关而受其它因素影响而改变的反应，为零级反应。化学动力学基础9.2底物浓度对酶反应速率的影响Substrateconcentrationeffectonthecatalysisrate9.2.1中间络合物学说S+E←→ES←→P+EEScomplexesReactioncoordinate(坐标)diagramcomparingenzyme-catalyzedanduncatalyzedreactions.Asimpleenzymaticreactionmightbewrittenas:02468101214161820020406080100ConcentrationofSubstrate(umol/L)RateofReaction(v)Reactionvelocityversussubstrateconcentrationinanenzymecatalyzedreaction.底物浓度对酶反应速率的影响底物浓度对酶反应速率的影响中间络合物学说的实验证明：1）ES复合物已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到。如DNA聚合酶Ⅰ可结合到它合成的DNA模板上。2）许多酶和底物的光谱特性在形成ES复合物后发生变化。底物浓度对酶反应速率的影响Structureofanenzyme-substratecomplex(cytochromeP-450boundtocamphor樟脑).底物浓度对酶反应速率的影响Changeinspectroscopiccharacteristicswiththeformationofanenzyme(tryptophansynthetase)-substrate(serineandindole吲哚)complex.3）酶的物理性质，如溶解度和热稳定性，在形成ES复合物后发生变化。4）已分离得到的酶与底物相互作用生成的ES复合物。5）超离心沉降过程中，可观察到酶与底物共沉降现象。底物浓度对酶反应速率的影响TheexistenceofEScomplexeshasbeenshowninavarietyofways:Thesaturationeffect:ataconstantconcentrationofanenzyme,thereactionrateincreaseswithincreasingsubstrateconcentrationsuntilaVmaxisreached.EScomplexeshavebeendirectlyobservedbyelectronmicroscopyandX-raycrystallography.ThespectroscopiccharacteristicsofmanyenzymesandsubstrateschangeonformationofanEScomplex.9.2.2酶促反应的动力学方程式9.2.2.1米氏方程的推导Michaelis-MentonequationVmax·[S]v=──────Ks+[S]LeonorMichaelisandMaudMenten(1913),Diekineticderinvertinwirkung,Biochem.Z.,19,333-369.Michaelis-MentonequationMichaelis-Mentonequation1925,Briggs&Haldane,Steadystatek1k3E+SESE+Pk2k4Michaelis-Mentonequation当反应系统中ES复合物的生成速率和ES复合物的分解速率相等时，ES复合物浓度保持不变的反应状态称为稳态（steadystate）。k1E+SESE+Pk4（1）ES复合物生成速率：v1=k1[E]游离·[S]游离+k4[E]游离·[P]因为[P]很小，可忽略不计（[P]表示产物的浓度）[E]游离＝[E]-[ES]（[E]表示酶的总浓度）[S]游离＝[S]-[ES]≈[S]（[S]表示底物的总浓度）所以v1=k1([E]-[ES])·[S]－－－－－－－－－方程(1)Michaelis-Mentonequation（2）ES复合物分解速率：v2=k2[ES]+k3[ES]－－－－－－方程(2)k3E+SESE+Pk2Michaelis-MentonequationMichaelis-Mentonequation（3）因为在稳态下，v1=v2，所以k1([E]-[ES])·[S]=k2[ES]+k3[ES]－－方程(3)移项，得k1[E]·[S][E]·[S][ES]=＝－－方程(4)k1[S]+(k2+k3)[S]+(k2+k3)/k1令Km=(k2+k3)/k1，Km称为米氏常数[E]·[S][ES]=－－方程(5)[S]+KmMichaelis-Mentonequation（4）酶促反应速率v=k3[ES]k3[E]·[S]=－－－－方程(6)[S]+KmMichaelis-Mentonequationk1k3E+SESE+Pk2k4（5）当底物浓度[S]很高时，所有的酶被底物饱和形成ES复合物，酶促反应达到最大速率Vmax，此时[ES]=[E]Vmax=k3[ES]=k3[E]所以Vmax·[S]v=──────[S]+KmMichaelis-Mentonequation当[S]«Km时，当[S]»Km时，当[S]=Km时，Vmax·[S]v=──────[S]+Kmv==K[S]Vmax[S]Kmv==VmaxVmax[S][S]v==Vmax[S][S]+[S]Vmax2曲线1曲线2米氏常数(Michaelis-Mentonconstant)的物理意义：米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。Vmax·[S]v=──────[S]+Km米氏常数Km的意义Km是酶的一个重要的特征物理常数，Km的大小只与酶的性质有关，与酶的浓度无关；不同的酶具有不同Km值。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km值，可用来鉴别酶以及酶的最适（天然）底物。TheKmcanvarygreatlyfromenzymetoenzyme,andevenfordifferentsubstratesofthesameenzyme.1/Km值可用于近似地表示酶与底物之间的亲和程度：1/Km值大表示亲和程度大;1/Km值小表示亲和程度小。132mkkkK米氏常数Km的意义Vmax的意义在一定酶浓度下，Vmax是常数；Vmax值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Vmax值。当[S]很大时，酶被底物饱和，Vmax=k3[E]maxmmmmaxmmax4333]S[]S[VKKKVKVvQuestion:When[s]=3Km,whichisright?(A)(B)(C)(D)max21Vvmax43Vvmax32Vvmax54Vvk3(kcat)的意义由Vmax=k3[E]，得：k3表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（TN）或催化常数，即kcat。kcat的单位是S-1。kcat值越大，表示酶的催化效率越高。k3=Vmax[E]HowtomeasureKmandVmax?9.2.2.3利用作图法测定Km和Vmax值双倒数作图法HowtomeasureKmandVmax?Y=aX+bY=1/VX=1/[S]Adouble-reciprocalorLineweaver-Burkplot.Eisenthal和Cornish-Bowden直线作图法Vmax=v+v/[S]●KmHowtomeasureKmandVmax?Km其他影响酶反应速率的因素酶反应速率酶浓度抑制剂激活剂温度pH值。。。底物浓度9.3酶的抑制作用Theinhibitionofenzymaticactivity凡可使酶蛋白变性而引起酶活性丧失的作用称为失活作用(inactivation)。由于酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失而称为抑制作用(inhibition)。变性剂对酶的变性作用无选择性，而一种抑制剂只能使一种酶或一类酶产生抑制作用。Enzymeinhibitorsaremolecularagentsthatinterferewithcatalysis,slowingorhaltingenzymaticreactions.Theinhibitionofenzymaticactivity酶的失活作用和抑制作用作用概念蛋白质空间结构的变化选择性失活作用使酶蛋白变性而引起酶活力降低或丧失的作用较大无抑制作用改变酶的必需基团的化学性质，引起酶活力降低或丧失的作用无或很小有Theinhibitionofenzymaticactivitybyspecificsmallmoleculesandionsisimportant.Itservesasamajorcontrolmechanisminbiologicalsystems.Manydrugsandtoxicagentsactbyinhibitingenzymes.Inhibitioncanbeasourceofinsight(洞察力，理解)intothemechanismofenzymeaction:residuescriticalforcatalysiscanoftenbeidentifiedbyusingspecific(irreversible)inh