阿仑膦酸钠药物的分析

·综　述·基金项目：中国博士后科学基金资助项目（２００６０３９０３２２）；陕西省自然科学基金（２００６Ｂ１２）；国家自然科学基金（２０８７２１１９）作者简介：胡惠静，女，硕士　　通信作者：陈涛，男，博士，教授　　Ｔｅｌ：[phone]　　Ｅｍａｉｌ：[e-mail]阿仑膦酸钠药物的分析胡惠静，卢婷利，陈涛（空间生物实验模拟技术，国防重点学科实验室，西北工业大学生命科学院，西安７１００７２）摘要：目的　对国内外阿仑膦酸钠药物的各种分析方法及其原理、优缺点进行总结概括，并对阿仑膦酸钠新剂型含量测定进行探讨。方法　以国内外有代表性的论文为依据，进行分析、整理和归纳。结果　现有的分析方法解决了阿仑膦酸钠难以检测的难题，人们根据阿仑膦酸钠分子结构，已完成了不同阿仑膦酸钠检测方法的建立。不同的检测方法根据不同的检测机制，具有不同的检测灵敏度，在使用过程中根据具体需要适当的选择。结论　阿仑膦酸钠不同分析方法的建立为进一步深入研究阿仑膦酸钠奠定了基础，也为阿仑膦酸钠衍生物、新剂型的研究提供了依据。关键词：阿仑膦酸钠；分析方法；高效液相色谱法中图分类号：Ｒ９２７．２　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００７７６９３（２００９）０３０１９８０６ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＡｌｅｎｄｒｏｎａｔｅＨＵＨｕｉｊｉｎｇ，ＬＵＴｉｎｇｌｉ，ＣＨＥＮＴａｏ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＳｐａｃｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＴｈｅＦａｃｕｌｔｙｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎＰｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ′ａｎ７１００７２，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏｓｕｍｍａｒｉｚｅｔｈｅａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｏｆａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅｉｎｔｅｒｎａｌａｎｄａｂｒｏａｄａｎｄｓｕｍｍａｒｉｚｅｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｄｉｓｃｕｓｓｔｈｅａｓｓａｙｏｆａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅｉｎｎｅｗｄｏｓａｇｅｆｏｒｍ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｔｉｐｉｃａｌｔｈｅｓｉｓｅｓｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌａｎｄａｂｒｏａｄ，ｗｅａｎａｌｙｚｅｄ，ａｒｒａｎｇｅｄａｎｄｓｕｍｅｄｕｐｔｈｅａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｏｆａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｔｈｅｓｅａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｍａｄｅａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅａｎａｌｙｓｉｓｐｏｓｓｉｂｌｅ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｈａｄｂｕｉｌｔｍａｎｙａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｏｆａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｕｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｈａｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｉｎｃｉｐｌｅａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｏｐｅｏｐｌｅｓｈｏｕｌｄｃｈｏｏｓｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｔｈｅａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅｓｔｕｄｙ，ｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｒｕｇｓｔｕｄｙｏｆａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅａｎｄｔｈｅｎｅｗｄｏｓａｇｅｆｏｒｍｓｔｕｄｙ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ａｌｅｎｄｒｏａｎｔｅ；ａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄ；ＨＰＬＣ　　阿仑膦酸钠（Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅｓｏｄｉｕｍ）是一种骨代谢调节剂，为氨基二膦酸盐，化学名为４胺基１羟基亚丁基。它与骨内羟基磷灰石有强亲和力。能进入骨基质羟基磷灰石晶体中，当破骨细胞溶解晶体，药物被释放，能抑制破骨细胞活性，并通过成骨细胞间接起抑制骨吸收作用。其特点是抗骨吸收性强，无矿化抑制作用［１２］。它避免了前两代药物的许多缺陷和不足，对骨吸收的抑制作用是第一代产品Ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ的１０００倍，是第二代产品Ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ的１０倍［３］，在国际上被认为是二十一世纪最具潜力的骨质疏松症药物，１９９５年被美国ＦＤＡ推荐为骨质疏松症的治疗用药［４］。阿仑膦酸钠分子结构中含有两个膦酸基团见图１，极性强，易电离，不能在反相色谱柱上保留；由于其结构中无生色团，因此不能直接用常规的紫外检测器和荧光检测器检测。从分析的角度看，阿仑膦酸钠自身的分子结构特点使其成为生物样品中阿仑膦酸钠药物含量分析的难题。但是，已有报道几种ＨＰＬＣ通过柱前衍生或柱后衍生生成阿仑膦酸钠衍生物从而检测阿仑膦酸钠。同时也有人报道可使用示差折光检测器直接进行阿仑膦酸钠ＨＰＬＣ分析、使用导电检测器进行阿仑膦酸钠离子色谱检测及间接的ＵＶ检测。笔者就阿仑膦酸钠药物的各种分析方法作一综述总结。图１　阿仑膦酸钠结构式Ｆｉｇ１　Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅｓｏｄｉｕｍ·８９１·ＣｈｉｎＪＭＡＰ，２００９Ｍａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２６Ｎｏ．３　　　　　　　　　　　　　　　中国现代应用药学杂志２００９年３月第２６卷第３期１　酸碱电位滴定法滴定分析方法快速、准确、仪器设备简单、操作简便，在双膦酸盐类药物的分析中得到广泛的应用。双膦酸盐类药物含有两个膦酸基团，是四元有机膦酸，呈现多极电离，因此最初以酸碱滴定法作为该类药物的分析方法。杨敏等［５］以０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１的氢氧化钠溶液为滴定液，饱和甘汞电极为参比电极，玻璃电极为指示电极，对原料药阿仑膦酸钠进行含量测定。测得含量均大于９９．５％，ＲＳＤ为０．０３３％，结果准确，方法简单，适合于生产上原料药的快速质控。但由于阿仑膦酸钠的四元酸均属于较弱酸，酸碱滴定突越不明显，且受酸性杂质干扰，因此酸碱滴定法不能成为阿仑膦酸钠药物分析的理想方法。２　钼蓝比色法钼蓝比色法是根据阿仑膦酸钠分子中含ＣＰ键，可被定量氧化为ＰＯ４３－，ＰＯ４３－在酸性条件下可与钼酸铵反应生成磷钼黄，之后再用还原剂对甲氨基酚硫酸盐将磷钼黄还原成磷钼蓝，钼蓝系ＭｏＯ２及ＭｏＯ３的混合物，其化学反应式见图２。龙明立等［６］用钼蓝比色法测定复方阿仑膦酸钠片中阿仑膦酸钠含量，检测波长７１０ｎｍ。实验表明阿仑膦酸钠在３．０～３６．０μｇ·ｍＬ－１浓度范围内呈良好的线性关系（ｒ＝０．９９９９，ｎ＝７），平均回收率为１００．６２％（ＲＳＤ＝１．２９％，ｎ＝９）。该法能克服阿仑膦酸钠分子结构本身无紫外吸收的特点，准确、方便、快速测定阿仑膦酸钠的含量。图２　钼蓝比色法测定阿仑膦酸钠原理图Ｆｉｇ２　Ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍｂｌｕｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ　　但钼蓝比色法的测定波长及结果易受还原剂种类、性质及溶液酸度等因素的影响，而且操作繁琐，张彦凯等［７］将该法做了改进，鉴于阿仑膦酸钠经氧化破坏可定量生成ＰＯ４３－，且ＰＯ４３－又能与钼钒酸盐形成具有紫外吸收活性的络合物，利用钼黄比色法测定阿仑膦酸钠片含量。钼黄法是使生成的磷酸盐在酸性溶液中用钒钼酸处理形成磷钒钼酸复合体（ＮＨ４）３ＰＯ４·ＮＨ４ＶＯ３·１６ＭｏＯ３。该法克服了钼蓝比色法的上述不足，具有简便、快捷、重复性好的优点。３　紫外分光光度计法阿仑膦酸钠没有强的生色基团，没有紫外吸收，故不能用ＵＶ检测器直接检测。通过阿仑膦酸钠与生色基团衍生生成有紫外吸收的衍生物来检测阿仑膦酸钠的含量，是一种简单易行，低成本的方法。Ｋｕｌｊａｎｉｎ等［８］研究了阿仑膦酸钠与ＦｅＣｌ３在高氯酸溶液中衍生的最佳条件及建立了阿仑膦酸钠紫外分光光度计检测的方法。该研究表明阿仑膦酸钠与Ｆｅ３＋是１∶１络合衍生的，条件稳定常数为ｌｏｇＫ＝４５。该方法可以检测浓度范围在８１～１６２５μｇ·ｍＬ－１阿仑膦酸钠，检测最低浓度为２μｇ·ｍＬ－１。可直接用于阿仑膦酸钠片剂中阿仑膦酸钠含量的测定。但是，由于该法不能区分阿仑膦酸钠的降解产物及阿仑膦酸钠化合物，故该法不能用来检测阿仑膦酸钠的稳定性及纯度。Ｄｒａｚｅｎ等［９］利用阿仑膦酸钠易与金属鳌合的性质，建立了阿仑膦酸钠与Ｃｕ２＋鳌合形成具有紫外吸收的衍生物，从而可用普通的ＵＶ／Ｖｉｓ检测器检测。该法为进一步采用紫外分光ＨＰＬＣ检测阿仑膦酸钠奠定了基础。４　高效液相色谱法４１　紫外检测的ＨＰＬＣ通过在流动相中加入紫外吸收试剂或生成具有紫外吸收的阿仑膦酸钠衍生物，从而使用间接紫外检测，建立阿仑膦酸钠的紫外检测ＨＰＬＣ。Ｒｏｌｆ等［１０］建立了阴离子柱在线衍生生成紫外吸收的物质的检测方法。该方法中二膦酸盐在酸性条件下与Ｃｕ２＋络合后用紫外检测。该法研究了ｐＨ值、Ｃｕ２＋浓度、硝酸浓度对不同二膦酸盐滞留时间的影响。同时也检测了阿仑膦酸钠、氯屈膦酸钠等二膦酸盐在线衍生络合洗脱的滞留时间。以下是帕米膦酸钠在线衍生过程（ｐＨ２．８）三个主要的平衡方程式：表１是在线衍生法紫外检测测得的几种二膦酸盐的滞留能力，流动相为１ｍｍｏｌ·Ｌ－１硝酸铜和２ｍｍｏｌ·Ｌ－１硝酸。其中Ｋ′＝（ｔｒｔ０）／ｔ０，ｔｒ是二膦酸盐的保留时间，ｔ０是溶剂的保留时间。表１　二膦酸盐及其他化合物的保留时间Ｔａｂ１　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｏｆｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓａｎｄｏｔｈｅｒｃｏｍｐｏｕｎｄｓ化合物滞留能力（ｋ′）奈立膦酸盐０．３３阿仑膦酸盐０．４８帕米膦酸酸盐０．７１奥帕膦酸盐０．８２依替膦酸盐４．１２氯屈膦酸盐２６．４硝酸盐２．５８磷酸盐６．５０·９９１·中国现代应用药学杂志２００９年３月第２６卷第３期　　　　　　　　　　　　　　　ＣｈｉｎＪＭＡＰ，２００９Ｍａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２６Ｎｏ．３　　在线配位紫外检测ＨＰＬＣ是一种简单、灵敏的提高色谱分离度和检测灵敏度的方法。与其他分析方法相比，优点如下：①应用了较常用的、稳定的紫外检测方法，提高了检测灵敏度与精密度。②流动相中Ｃｕ２＋的存在使分析物得以保留，能将双膦酸盐类化合物从不同性质的组分中分离出来。③此方法具有特异性，只能灵敏地检测到与Ｃｕ２＋有较强配位能力的分析物。美国药典提出了一种阿仑膦酸钠色谱纯度测量方法，以柠檬酸钠二水合物和无水磷酸氢二钠的水溶液作为缓冲溶液，再以该缓冲溶液与乙腈不同配比作为流动相进行梯度洗脱。阿仑膦酸钠先与氯甲酸９芴甲酯溶液（ＦＭＯＣ）衍生生成既有荧光吸收又有紫外吸收的衍生物，再用紫外检测器在２６６ｎｍ进行检测阿仑膦酸钠的纯度。４２　荧光检测的ＨＰＬＣ与美国药典提出的阿仑膦酸钠纯度检测方法异曲同工的还有Ｐｔａｃｅｋ等［１１］建立了一种检测尿液样品中阿仑膦酸钠含量的柱前衍生ＨＰＬＣ。该方法中阿仑膦酸钠先与ＦＭＯＣ在柠檬酸钠水溶液中（ｐＨ１１９）中衍生，刚开始用流动相乙腈甲醇缓冲溶液（由焦磷酸钠与柠檬酸摩尔比１∶１组成）（２０∶１５∶６５）洗脱，到７５ｍｉｎ用乙腈甲醇水（１３∶５７∶３０）洗脱，最后再用最初流动相洗脱，总共走２１ｍｉｎ。最后用激发光波长为２６０ｎｍ和发射光波长为３１０ｎｍ荧光检测器检测。结果表明阿仑膦酸钠浓度可以检测到３５ｎｇ·ｍＬ－１，相对标准偏差不超过８％，不准确性低于９％，该法可用于阿仑膦酸钠药物代谢动力学的研究。Ｙｕｎ等［１２］用相类似的方法，以帕米膦酸钠为内标，建立了测定血浆中阿仑膦酸钠含量从而研究阿仑膦酸钠代谢动力学的方法，检测最低限为１ｎｇ·ｍＬ－１。由于阿仑膦酸钠与ＦＭＯＣ衍生主要是ＦＭＯＣ可与阿仑膦酸钠中的氨基反应生成荧光检测物质见图３，故该法不适用于无氨基的二膦酸盐。图３　阿仑膦酸钠与ＦＭＯＣ反应的方程式Ｆｉｇ３　ＴｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅａｎｄＦＭＯＣ　　孙俐文等［１３］建立了反相高效液相色谱法测定帕米膦酸二钠的含量的方法。该方法采用Ｃ１８色谱柱，以乙腈０４％乙二胺四醋酸二钠的氢氧化钠溶液（１４∶８６）为流动相，用间接荧光检测，激发光波长３９５ｎｍ，发射光波长４８０ｎｍ测定了帕米膦酸钠的含量。由于该法主要是荧光胺本身及其水解产物不显荧光，但与帕米膦酸钠中的伯氨基团反应形成高度荧光衍生物的物质而使其能够用荧光检测器检测见图４，故该