呼吸道病毒7项检测试剂

..上海复星医学科技发展有限公司呼吸道病毒7项检测试剂2011-1-10..呼吸道病毒7项检测试剂目录1．概述..................................................12．D3UltraDFA试剂......................................22.1D3UltraDFA试剂规格.................................................22.2D3UltraDFA试剂用途.................................................22.3D3UltraDFA试剂特点和优势...........................................22.4D3UltraDFA试剂实验操作步骤.........................................32.5D3UltraDFA试剂实验结果判读.........................................43．D3UltraDFA试剂竞争优势..............................53.1检验的特异性和灵敏度.................................................53.2市场竞争.............................................................5附录1七种病毒检测的临床意义.............................7附录2实验室所需设备清单（试剂盒中不含）.................8附录3进口荧光显微镜参数.................................9..1．概述日常生活中，几种常见的呼吸道病毒往往给人们的工作和生活带来极大的不便，有些甚至威胁到人们的健康和生命。在医院和急诊室中，这些呼吸道病毒也常常是诊断和治疗的难题。常见的呼吸道病毒包括：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型和副流感病毒3型。在病毒检测方法中，抗原检测有其无法比拟的优势：1.可以用于病毒的早期诊断，这对治疗非常重要；2.快速、简便的诊断方法，短时间内得出结果，节省实验室的劳动力和成本。DHI公司的D3UltraDFA试剂属于抗原检测中的直接免疫荧光法。该试剂可以同时筛查和鉴定出常见的7种呼吸道病毒。D3UltraDFA试剂主要的测试对象为婴幼儿和儿童，所以目标客户群体为：儿童医院、妇幼保健院和有儿科的三甲医院。..2．D3UltraDFA试剂2.1D3UltraDFA试剂规格D3UltraDFA试剂分为7项呼吸道病毒筛查试剂和7项呼吸道病毒鉴定试剂。检测病毒种类：A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，1、2、3型副流感病毒。具体规格如下：筛查试剂：10mL，可用于400次测试鉴定试剂：每项鉴定试剂2mLX7，可用于80次测试另外，每盒试剂中含有40x浓缩洗液25mL，固定液15mL，正常鼠丙种球蛋白试剂10mL（用于阴性质控），含有7种呼吸道病毒抗原的阳性质控板5块。2.2D3UltraDFA试剂用途D3UltraDFA试剂能对疑似呼吸道病毒感染的患者进行快速的病毒筛查和鉴定。及时、准确地诊断对于病人的治疗非常重要，这主要体现在以下几点：1、病毒治疗针对性强金刚烷乙胺、瑞乐沙、奥司他韦（达菲）等是抗流感病毒的特效药。RSV和副流感病毒可以使用利巴韦林和免疫球蛋白进行治疗。目前没有专门的抗腺病毒药物，主要采取支持疗法。2、病毒治疗有时效性大部分呼吸道病毒越早治疗效果越好。比如，奥司他韦在体内的活性形式是一种强效的高选择性的流感病毒NA抑制剂，它主要通过干扰病毒从被感染的宿主细胞中释放，从而减少甲型或乙型流感病毒的传播。因此，在出现流感症状的48小时内使用奥司他韦才有用，过了这个时间段后疗效甚微。3、避免抗生素的滥用病毒不同于细菌、衣原体、支原体等原核生物，其对抗生素不敏感，不能使用抗生素进行治疗。准确的诊断能帮助医生确定是否使用抗生素来治疗病人。2.3D3UltraDFA试剂特点和优势1、产品几乎覆盖了所有常见呼吸道病毒的诊断2、采用直接免疫荧光法，较其他检测方法有较大优势（详见表一）..3、实验步骤较简便，在短时间内能得出结果，从而帮助医生更好地治疗病人4、使用质量优异的抗体，染色步骤仅需15分钟，大大节省了实验室的劳动力和成本，同时提高了临床诊断的成功率，减少重复实验5、可以监控感染的大规模流行6、拥有强大的科研团队，不断研制和改进单克隆抗体表1、几种常用检测方法的比较检测方法优点缺点病毒分离培养特异性高耗时耗力，灵敏度较低抗原检测酶联免疫吸附法较快速、简便有非特异性反应间接免疫荧光法较快速有非特异性反应直接免疫荧光法（D3UltraDFA试剂）快速、简便，灵敏度和特异性均较高需要使用荧光显微镜血清学检测快速、特异性较高对疾病初期诊断没有太大帮助分子生物学方法较快速，灵敏度和特异性均较高操作繁琐，价格昂贵2.4D3UltraDFA试剂实验操作步骤1、样品准备步骤：①将样本充分震荡混匀约10-15秒。②在400-600xg转速下离心5-10分钟。③弃上清（如果预留上清可用于细胞培养）。④在沉淀中加5mLPBS缓冲液（请使用普通PBS，不要使用试剂盒内配套的浓缩洗液），充分震荡混匀约10-15秒。⑤在400-600xg转速下离心5-10分钟。⑥吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀。⑦重复步骤4到6，直至黏液层被完全去除。注意：一定要将黏液去除干净，否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。⑧在沉淀中加0.5到1mL的PBS缓冲液。⑨用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。这个悬浊液可用于直接样本测试。2、直接样本测试步骤：①在2孔或8孔板上的每孔内滴加25µL的细胞悬浊液。..②样本完全风干。③在20ºC到25ºC，用预冷的100%丙酮固定细胞约5到10分钟。注意：丙酮是易挥发、可燃性物质，使用时请远离明火。④从丙酮中取出载玻片并风干。⑤在固定并风干的细胞上滴加一滴DFA染色试剂（如图1），使其完全覆盖细胞（注意：2孔或8孔板上有一孔是阴性对照孔，请勿滴加DFA染色试剂）。⑥在呼吸道病毒抗原对照板的每孔内也要滴加DFA染色试剂。抗原对照板包含了被病毒感染的细胞和未感染的细胞，只能一次性使用。⑦在阴性对照孔内滴加正常鼠丙种球蛋白试剂，使其完全覆盖细胞。⑧将载玻片放于35ºC到37ºC的恒温箱内孵育15到30分钟，为保持其湿润最好放置于带盖的盒子内。⑨用事先稀释好的洗液漂洗染色细胞。为了更有效地洗涤，请将玻片在洗液中反复浸蘸4次左右。⑩使用新的1X洗液再洗一次。⑪用去离子水再洗一遍。图1、在玻璃板上滴加D3UltraDFA染色试剂3、观察实验结果滴加2到3滴固定液，并加盖盖玻片（20X50mm），要注意避免产生气泡。在200倍放大荧光显微镜下观察结果。2.5D3UltraDFA试剂实验结果判读..带FITC标记的抗体在荧光显微镜下会呈现明亮的绿色，如果细胞表面存在病毒抗原，染色后就会显绿色。在荧光显微镜下，感染不同病毒的细胞会呈现独有的特征（如图2）。图2、显微镜下观察染色细胞（注：根据不同荧光显微镜，背景色不一定为红色）3．D3UltraDFA试剂竞争优势3.1检验的特异性和灵敏度检验的特异性:用D3UltraDFA呼吸道病毒筛查和鉴定试剂对多种细胞和微生物进行交叉反应测试。对64种病毒、18种细胞、19种细菌均没有交叉反应。检验的灵敏度：荧光标记的单克隆抗体平均能检测出病毒的最低浓度约为1.0PFU。3.2市场竞争主要竞争对手为西班牙Vircell公司的9项呼吸道产品。D3UltraDFA试剂与其主要有两点不同：1.检测项目不同；2.检测原理不同..1、Vircell产品检测项目除了以上7种病毒外，还包含肺炎衣原体、支原体等原核生物检测项目。但是，90%的感冒是由病毒引起的。如果是细菌、衣原体、支原体等感染，一般白细胞和C-反应蛋白（CRP）都会显著升高，而病毒感染，这两项指标一般不会升高。我们建议医生可以先做血常规或者CRP检测，这样就能区分是病毒还是细菌感染，而这两项测试不仅快速（一般20-30分钟），而且价格相对便宜。2、D3UltraDFA试剂的检测原理是用荧光（FITC）标记的单克隆抗体检测病毒抗原，属于直接荧光免疫法。Vircell产品的检测原理是用抗原检测抗体（IgM），使用的方法是间接免疫荧光法。虽然检测IgM能区分出是既往感染还是急性感染，但是抗体产生的个体差异较大，特别是1岁以下的婴幼儿和有免疫缺陷的人群，其抗体往往产生较慢。短时间内，在体内抗体不足的情况下，可能会出现假阴性，从而错过了治疗的最佳时期。甲型流感病毒其表面抗原变异较快，而人体往往不能及时产生针对新毒株的抗体，这时也会造成假阴性。间接免疫荧光法会增加非特异性反应的几率。表2、Vircell与D3UltraDFA试剂对比*备注：引用自《流行性感冒诊断与治疗指南（2011年版）》VircellD3UltraDFA检测项目9项呼吸道病原体，其中包含在我国发病率很低的Q热立克次氏体只检测呼吸道病毒，降低患者的看病成本，患者更易接受检测原理需要体内产生抗体后才能检测出病原体，如果抗体产生较慢或者无抗体产生会有假阴性只要有病原体存在即可检测，可在发病早期进行快速诊断临床意义*作为回顾性诊断，对病例的早期诊断意义不大可用于疾病早期诊断，对患者的治疗有重大意义检测灵敏度不能很好地检测变异的病毒将多种抗体进行组合，能更好地应对变异的病毒，在多项检测项目中灵敏度达到100%检测方法间接免疫荧光法，二抗的使用会增加非特异性反应直接免疫荧光法，特异性提高实验步骤二抗的使用让实验步骤变得较为繁琐一步染色，不易交叉污染..附录1七种病毒检测的临床意义流感病毒侵入呼吸道，经1-2天的潜伏期，感染者即可出现流感症状。病毒在上皮细胞内复制，很少入血，但可释放内毒素样物质入血，引起全身中毒症状：发热、头痛、全身酸痛、疲乏无力、白细胞数下降等。幼儿或年老体弱病人感染流感病毒易继发细菌感染，如合并肺炎等，病死率高。婴幼儿特别是2-6个月的婴儿对RSV特别敏感，常引起较为严重的呼吸道疾病，如细支气管炎、肺炎等，患儿常出现呼吸暂停，气管或细支气管坏死物与粘液、纤维蛋白等结集在一起，极易阻塞患儿的呼吸道，严重者造成死亡。在我国RSV还是引发流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起婴幼儿尤其是新生儿较高的死率。腺病毒主要引起呼吸道感染，症状有急性发烧、咽炎、扁桃体炎等。腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10%，多由腺病毒3、7型引起；婴幼儿腺病毒肺炎的病死率为8%-10%。除呼吸道疾病外，腺病毒亦可引起其他疾病，如流行性角膜炎、出血性结膜炎、急性滤泡性结膜炎等。腺病毒与婴幼儿胃肠道疾病也有可能相关，包括阑尾炎、急性胃肠炎，有时可引起脑炎和脑膜炎、出血性膀胱炎等。副流感病毒是引起小儿急性呼吸道感染的常见病因，仅次于RSV。副流感1、2型是哮喘的主要病因，以2-4岁儿童中最为严重。副流感3型，亦可引起哮喘，但主要易引起婴幼儿支气管炎、肺炎，并以1岁以内的婴儿较为严重。病毒及其对应抗病毒药病毒种类抗病毒药物流感病毒金刚烷乙胺、瑞乐沙、奥司他韦（达菲）呼吸道合胞病毒利巴韦林喷雾剂副流感病毒病情严重者可使用利巴韦林腺病毒没有专门的抗病毒药物，主要采取支持疗法..附录2实验室所需设备清单（试剂盒中不含）此列表中的器材和试剂是实验所必需的，但是未包含在试剂盒中，需要单独购买。器材和试剂规格1鼻咽拭子建议使用DHI配套鼻咽拭子2载玻片约70mmX20mm3盖玻片约50mmX20mm4生物安全柜2级5恒温培养箱35ºC-37ºC6离心机管式7荧光显微镜可以看FITC（490/520nm），总200倍光学变焦8烧杯多