华东理工 基因工程 10

A重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则10外源基因表达产物的分离纯化针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型等电点处于极端区域（pI≤5或pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8-10-4mol/L）；疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。多种分离纯化技术的联合运用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉分离纯化过程的规模化蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。B离子交换层析10外源基因表达产物的分离纯化离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换层析的基本操作离子交换介质的选择原则离子交换层析的基本原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。离子交换介质的基本性质离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子交换剂的基本性能离子或阴离子起交换作用如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而解离下来不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的离子交换介质的基本性质阴离子交换剂：强碱型和弱碱型可电离的基团磺酸基（-SO3H）离子交换剂的分类磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）酚羟基（-OH）阳离子交换剂：强酸型和弱酸型可电离的基团伯胺基（-NH2）仲胺基（-NHCH3）叔胺基（-N(CH3)2）季胺基（-N+(CH3)3）离子交换介质的基本性质离子交换剂的分类强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换树脂：最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换纤维素：离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等维素）阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（SephadexG）Sephadex的优点如下：亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快既有离子交换作用，又有分子筛效应因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换葡聚糖：常用的离子交换葡聚糖包括：阳离子交换剂CM-SephadexC-25，CM-SephadexC-50SephadexC-25，SephadexC-50阴离子交换剂DEAE-SephadexA-25，DEAE-SephadexA-50QAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-50离子交换介质的基本性质常用的离子交换剂离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的SepharoseCL-6BDEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点此具有稳定的外形体积离子交换介质的选择原则一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化碱性物质用阳离子交换剂分离曲线来选择离子交换介质的选择原则12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂pHpI（+）pH=pI（0）pHpI（-）对pI=5的某酸性蛋白质在pH5.5-9.0的范围内，当蛋白质为阴离子时，应首选DEAE纤维素；在pH3.5-4.5的范围内，当蛋白质为阳离子时，应首选CM纤维素离子交换层析的基本操作层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要离子交换层析的基本操作样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数离子交换层析的基本操作样品洗脱恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱102030405060708090分子浓度离子强度pH值C凝胶层析10外源基因表达产物的分离纯化凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本原理凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。凝胶介质的基本性质葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温葡聚糖凝胶（Sephadex）SephadexLH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤凝胶介质的基本性质琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（Sepharose2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比）和Bio-Gel-A等（Bio-Gel-A0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排阻限度。琼脂糖凝胶当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。SepharoseCL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。凝胶介质的基本性质聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种聚丙烯酰胺凝胶（数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）凝胶介质的选用原则将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。组别分离一般选用SephadexG-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用SephadexG-10、G-组别分离15、Bio-GelP-2或P-4凝胶介质的选用原则将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由分级分离于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。凝胶层析的基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡层析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定恒定的操作压是恒流的先决条件凝胶层析的基本操作上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好D亲和层析10外源基因表达产物的分离纯化亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析的基本操作亲和层析的基本概念亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：纯化过程简单、迅速，且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子亲和层析的基本特点纯化倍数大，产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围受到一定的限制亲和层析的基本概念抗原与抗体DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子激素或药物与其受体具有特异性亲和作用的生物分子维生素于其特异性结合蛋白糖蛋白与其相应的植物凝集素亲和层析的基本概念亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结亲和层析的基本原理合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来亲和层析载体的性质与选择具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速亲和层析载体的选择具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合偶联在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性亲和层析载体的性质与选择纤维素葡聚糖凝胶常用的亲和层析载体琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体亲和层析配基的性质与选择纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力但亲和力太高也是