DNA的粗提取与鉴定

DNA的粗提取与鉴定一、基础知识(原理）1、提取与提纯生物大分子（DNA）的基本思路利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分DNA的溶解性（氯化钠溶液、酒精溶液）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性2、DNA的鉴定①DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂②甲基绿（蓝绿色）（1）、DNA的溶解性（NaCl溶液）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反提取DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离（2）、DNA在酒精溶液中的溶解性（3）、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响②大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响提取二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料）2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐2、植物细胞讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？（三）去除滤液中的杂质讨论：滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计结合相关原理，分析下列三个方案讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质用高浓度的盐溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离（四）DNA的析出与鉴定DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1、DNA的析出二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计2、DNA的鉴定鉴定DNA时，先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色（四）DNA的析出与鉴定二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长1、鸡血细胞做实验材料的原因①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得2、实验原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。③DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例3、实验材料和用具：鸡血细胞液（5--10ml）；体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；蒸馏水；质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸纳溶液；物质量的浓度分别为2mol/L和0．0.015mol/L的氯化纳溶液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例4、课前制备鸡血细胞液取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。）实验时。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。①过程案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例②柠檬酸钠作用防止血液凝固鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液③注意事项讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？除去的上清液是血浆，增大血细胞浓度，有利于血细胞在蒸馏水中破裂。案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例4、课前制备鸡血细胞液5、方法步骤将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。①提取细胞核物质（破碎细胞，释放DNA）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例讨论：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？用玻璃棒搅拌可以加速血细胞及细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA②溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol／L）③析出DNA5、方法步骤案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例讨论：加入蒸馏水的目的？降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕注意事项：④滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤③中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上⑤将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中5、方法步骤案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤⑤中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中⑦提取含杂质较少的DNA在上述滤液中，加入冷却的、体积分数为95％的酒精溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物（絮状沉淀）。用玻璃棒将丝状物卷起，用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA5、方法步骤案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中预冷的酒精具有以下优点：抑制核酸水解酶活性；降低分子运动，易于形成沉淀析出；增加DNA分子柔韧性，减少断裂。讨论：（2）观察丝状物呈什么颜色？答：白色（1）为什么要加50mL的冷酒精？取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015mol／L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化⑧DNA的鉴定讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色（2）这一鉴定结果说明什么问题？（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是DNA（3）DNA的直径约为20×10-10m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？答：DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”讨论：①两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破第一步第二次：使DNA黏稠物析出第三步此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层②三次过滤第一次：DNA存在于滤液里第一步第二次：DNA被留在纱布上第四步第三次：DNA存在于滤液里第六步③两次析出第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液第三步第二次：用冷却的95％的酒精第七步④六次搅拌：第一、二、三、五、七、八步其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”讨论：此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？（二）案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取1、课前准备将新鲜菜花和体积分数为95％的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h2、提取DNA的具体步骤①取材：称取30g菜花，去梗取花，切碎②研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min研磨液的配制方法如下：将10.1gTris加入到50mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2moL/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76gNaCl、37.2gEDTA、20gSDS。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1000mLTris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNASDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离③过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心