内生固氮菌HAUM10对水稻的侵染定殖规律及促生效应

内生固氮菌HAUM10对水稻的侵染定殖规律及促生效应摘要：试验以从表面灭菌的稗草中分离到的一株内生固氮菌ｈａｕｍ１０为对象，研究发现该菌具有较强的产固氮酶和吲哚乙酸能力。乙炔还原法测定其所产固氮酶的活性为０．８２４μｍｏｌｃ２ｈ４／（ｍｌ·ｈ），液相色谱法测定其产吲哚乙酸量为１５．４４μｇ／ｍｌ。将ｈａｕｍ１０用ｇｆｐ基因标记后接种水稻，观察其在水稻中的侵染定殖规律，发现在接种后第7天，ｇｆｐ标记的ｈａｕｍ１０主要定殖于根内通气组织和韧皮部细胞，少量定殖在叶鞘中。盆栽试验表明，ｈａｕｍ１０促进水稻叶绿素合成，有利于光合作用，在水稻生长后期促进氮、磷元素由叶向穗转移。关键词：内生固氮菌；水稻；侵染；定殖；促生infectionandcolonizationofendophyticdiazotrophhaum10onriceseedlingsanditsplantgrowth-promotingroleｔａｏｙａｎ－ｈｕｉ，ｌｉｎｈｕｉ，ｚｈａｏｂｉｎ（ｓｔａｔｅｋｅｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｈｕａｚｈｏｎｇａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｗｕｈａｎ４３００７０，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：aｎｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｈａｕｍ１０ｗａｓｏｒｉｇｉｎａｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｕｒｆａｃｅ－ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａｃｒｕｓｇａｌｌｉanditｐｒｅｓｅｎｔｅｄａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅｌｅｖｅｌｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｉａａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．ｔｈｅｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ（ａｒａ）ｗａｓａｂｏｕｔ０．８２４μｍｏｌｃ２ｈ４／（ｍｌ·ｈ）．ｔｈｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｍｅｔｈｏｄｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏdeterminetheｉａａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈａｕｍ１０whichwasdetectedasｕｐｔｏ１５．４４μｇ/ｍl．ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｂｙｇｆｐ－ｔａｇｇｅｄｈａｕｍ１０ｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄ．ｈａｕｍ１０－ｇｆｐｗａｓｍａｉｎｌｙｃｏｌｏｎｉｚｅｄｗｉｔｈｉｎｔｈｅｒｏｏｔａｅｒｅｎｃｈｙｍａａｎｄｐｈｌｏｅｍａｔthe7thdayａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ；whileafewwasｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅｌｅａｆｓｈｅａｔｈ．ｐｏｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｔｒａｉｎｏｆｈａｕｍ１０ｉｎｃｒｅａｓｅｄtheｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｃｏｎｔｅｎｔｔｏｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｒｉｃｅａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄｔｈｅｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｆｒｏｍｌｅａｆｔｏｓｐｉｋｅｉｎｔｈｅｌａｔｅｇｒｏｗｔｈｏｆｒｉｃｅ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ；ｒｉｃｅ；ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ；ｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｏｎ水稻生长过程除了需要大量的水外，氮源是其最重要的生长因子。中国是世界上稻米的主要生产国和消费国之一，目前化肥是实现单位面积高产的重要因素之一，但中国占世界约７％的耕地面积中施用的氮肥高达全球氮肥总用量的３５％以上［１］。氮肥进入灌溉稻田后，通过氨的挥发、硝化－反硝化作用、表面流失等多途径损失，最终导致氮肥利用率降低。大量氮素损失导致一系列环境问题：地下水污染和江河湖泊的富营养化；饮用水中硝酸盐浓度高于１０ｍｇ／ｌ将导致婴儿高铁血红蛋白症和成人胃癌；ｎ２ｏ和ｎｏ的排放可能导致全球气候变暖［２］。生物固氮不仅可以为植物提供氮源缓解施用化肥带来的一系列危害，而且具有环保、高效、节能、高效等优点，因此研究利用生物固氮的方式为水稻提供氮源具有极其重要的意义。植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物不表现出外在症状，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物ｄｎａ的方法来证明其内生性［３］。内生菌对宿主植物的促生效应包括固氮、解磷、分泌植物激素、促进矿质元素吸收、生物防治等［４］。植物内生固氮菌（ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｄｉａｚｏｔｒｏｐｈ）是一类能定殖在健康植物体内，与宿主植物进行联合固氮的微生物。由于内生固氮菌在农作物体内不仅具有固氮活性，而且可能分泌植物激素等多种生物活性物质促进作物生长，因此，利用内生固氮菌对植物的促生效应，有可能开辟一条不同于根瘤菌与豆科作物互作促生的途径。考虑到与水稻生长环境相似、常与水稻发生营养竞争关系的稗草中可能存在某些有促生作用的内生固氮菌，故将稗草作为内生固氮菌分离的材料，研究了其中一株内生固氮菌在水稻中的侵染定殖规律及对水稻的促生效应。１材料与方法１．１材料内生固氮菌来源：ｈａｕｍ１０由华中农业大学微生物学国家重点实验室自华中农业大学实验基地的稻田沟渠稗草中分离得到。ｈａｕｍ１０单个菌体短杆状，不形成芽孢，具有运动性，革兰氏阴性。在营养琼脂平板上生长，单个菌落平滑，菌落淡黄色，半透明，中间凸起，粘着于培养基上；在无氮阿须贝氏培养基平板上，菌落透明黏稠，边缘不规则向周围扩展生长。根据ｈａｕｍ１０的生理生化性质和１６ｓｒｄｎａ序列比对结果，鉴定ｈａｕｍ１０是一株泛菌（ｐａｎｔｏｅａｓｐ．）。含ｇｆｐ基因的供体菌：大肠杆菌（ｅｓｃｈｅｉｃｈｉｃｏｌｉ）ｃｃｌｌ８λ／ｐｆａｊ１８２０，卡那霉素抗性［５］。由比利时鲁汶大学ｊ．ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ教授馈赠。三亲本杂交辅助菌：ｅ．ｃｏｌｉ（ｐｐｋ２０７３，ｓｐｅｒ）。１．２方法１．２．１扩增固氮酶ｎｉｆｈ基因，测定固氮酶活性首先用碱变性法［６］抽提haum10总ｄｎａ，并稀释100倍后作为模板。固氮酶ｎｉｆｈ基因扩增引物和反应程序参考ｕｅｄａ等［７］的方法。ｐｃｒ产物经琼脂糖凝胶电泳后用ｄｎａ纯化试剂盒回收，回收产物连接到ｐｍｄ１８－ｔ载体上，转化入ｄｈ５α，挑阳性克隆测序。乙炔还原法测纯培养的内生固氮菌所产固氮酶活性［６］。将改良的ｄｏ氏培养基［８］３ｍｌ分装于ｐａ瓶中灭菌后制成斜面，取等量内生固氮菌接种于ｄｏ氏培养基，２８℃培养４８ｈ后将ｐａ瓶上的硅胶盖换成不透气的橡胶塞。用注射器平衡瓶内外压力后，抽出１０％体积的空气，注入等体积的乙炔，继续在２８℃下培养２４ｈ。气相色谱仪测定乙烯生成量。１．２．２产吲哚乙酸试验ｃｃｍ培养基［９］：葡萄糖５ｇ，甘露糖５ｇ，苹果酸５ｇ，ｎｈ４ｃｌ１ｇ，去离子水１０００ｍｌ，ｐｈ５．８，加色氨酸０．２ｇ／ｌ。接种菌体于ｃｃｍ培养基中，生长１周；１００００ｇ离心１５ｍｉｎ，收集上清液；ｈｃｌ调节上清液ｐｈ为２．８；用等体积的乙酸乙酯抽提3遍；提取物４０℃水浴旋转蒸发真空浓缩至近干，然后加１ｍｌ无水乙醇悬浮；ｈｐｌｃ检测：采用ｃ１８色谱柱，ｖ甲醇∶ｖ醋酸∶ｖ水＝３０∶１∶７０为流动相，流速１．２ｍｌ／ｍｉｎ，λｉａａ＝２８０ｎｍ［１０］。１．２．３ｇｆｐ基因标记ｈａｕｍ１０及接合子的鉴定以抗生素利福平作为三亲本杂交试验受体菌的筛选标记，驯化ｈａｕｍ１０，得到抗１００μｇ／ｍｌｒｉｆ的ｈａｕｍ１０。三亲本杂交方法参考赵斌等［６］的方法。为了得到稳定表达的ｇｆｐ接合子，将三抗平板上得到的接合子菌体在无抗性的液体ｌｂ培养基中传20代，然后将菌液稀释１０７倍涂三抗（ｒｉｆ１００μｇ／ｍｌ，ｓｐｅ５０μｇ／ｍｌ，ｋｍ３０μｇ／ｍｌ）ｌｂ平板，即可得到较为稳定的ｇｆｐ接合子。鉴定转化子：在荧光显微镜下观察菌体是否发出绿色荧光，是否在三抗阿须贝氏培养基上生长；ｐｃｒ扩增菌体ｇｆｐ基因：挑转化子于三抗ｌｂ培养基生长至对数期后，取菌液３０μｌ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，倒掉上清液加入５０μｌ无菌去离子水并摇动均匀，１００℃、５ｍｉｎ后置冰上５ｍｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取１μｌ上清液作为模板。ｇｆｐ引物的设计：从ｇｅｎｂａｎｋ中搜索到ｇｆｐ基因的序列，根据ｇｆｐ基因全长设计引物。ｇｆｐｆ为５′－ａａｇｇａｇｇａｔａｔａｃａｔａｔｇｇｃｔａｇｃ－３′，ｇｆｐｒ为５′－ｃｃａａｇｃｔｔｇｃａｔｇｃｃｔｇｃａｇｇｔｃ－３′。反应体系（２０μｌ）：１０×ｐｃｒｂｕｆｆｅｒ２μｌ；ｄｎｔｐ（ｄａｔｐ、ｄｃｔｐ、ｄｔｔｐ和ｄｇｔｐ浓度均为２ｍｍｏｌ／ｌ）２μｌ；正反向引物（５０μｇ／ｍｌ）各０．８μｌ；模板ｄｎａ（１０ｎｇ/ml）１μｌ；ｔａｑ聚合酶（５ｕ／μｌ）０．２μｌ；加水至２０μｌ。反应程序：９４℃，预变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５７℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃继续延伸１０ｍｉｎ。１．２．４ｈａｕｍ１０在水稻中的侵染定植路径水稻（中花１１）种子表面灭菌处理参考文献［１０］的方法。将灭菌后的水稻种子铺于１％琼脂固体培养基中萌发５ｄ，选择健壮的幼苗剪少许根后移入２０ｍｌ装有水稻无氮营养液配置的半固体培养基（琼脂浓度３．２５ｇ／ｌ）的玻璃试管（口径２．５ｃｍ，长１９ｃｍ）中。接入无菌水悬浮的ｈａｕｍ１０－ｇｆｐ。管底作避光处理后，置智能光照培养箱（光照２７℃，１６ｈ/d；黑暗２５℃，８ｈ/d）培养。于接种后３、５、７ｄ分别取水稻幼苗，无菌水洗去表面附着菌体。在连续变倍体式显微镜下用不锈钢刀片切取水稻组织制作切片。激光扫描共聚焦显微镜λ４８８ｎｍ激发光下观察水稻各部位内生固氮菌存在状态。１．２．５ｈａｕｍ１０纤维素酶和果胶酶试验纤维素酶试验采用赵斌等［６］的纤维素水解试验方法一。配制果胶培养基［６］，０．１ｍｐａ灭菌５ｍｉｎ倒平板，每个平板点种４株菌株，２８℃倒置培养２～４ｄ。１．２．６盆栽试验观察ｈａｕｍ１０对水稻生长的影响盆栽试验设不接种（ｃｋ）和接种ｈａｕｍ１０两种处理，各４个重复，每个重复１盆（盆口径２０．５ｃｍ，高１９.0ｃｍ，土深１４.0ｃｍ）。水稻种子表面灭菌后，置于添加无菌水的平皿中，２８℃萌发５ｄ后，倒掉无菌水，加入无菌水悬浮的菌液浸苗过夜。每盆２５棵苗，等距种植。水稻生长过程浇自来水和无氮ｆａｈｒａｅｕｓ营养液。待水稻生长至分蘖期和灌浆期再各接种一次内生固氮菌剂。移栽后分别在第７、１４、２１、３０、４５天取样，将植株完全拔出后自来水冲洗干净。观察内生固氮菌在水稻不同部位的消长动态，不同时期测ｈａｕｍ１０在水稻体内的固氮酶活性［１０］。移栽后第４５天取水稻苗测叶片的叶绿素含量［１１］。第４５天和种子收获期取样消化［１２］后以凯氏定氮法和钼锑抗比色法分别测水稻氮和磷含量。２结果与分析２．１ｈａｕｍ１０固氮酶基因ｎｉｆｈ及固氮酶活性ｎｉｆｈ基因是蛋白酶多肽的３个功能基因ｎｉｆｈｄｋ之一，扩增片段大小为３９０ｂｐ（图１）。测序结果在ｎｃｂｉ数据库中经ｂｌａｓｔ比对，与成团泛菌（ｐａｎｔｏｅａａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）的ｎｉｆｈ序列覆盖率为７５％，同一性为９６％。乙炔还原法测定ｈａｕｍ１０的固氮酶活性为０．８２４μｍｏｌｃ２ｈ４／（ｍｌ·ｈ）。２．２产吲哚乙酸试验结果分析高效液相色谱法测定吲哚乙酸标准品的出峰时间是１１．０２０ｍｉｎ（图２ａ），确定ｈａｕｍ１０发酵液出峰时间为１１．１７３ｍｉｎ的峰图是其所产吲哚乙酸的峰图（图２ｂ），可得ｈａｕｍ１０产吲哚乙酸量为１５．４４μｇ／ｍｌ。２．３ｇｆｐ标记菌株的鉴定ｈａｕｍ１０与供体菌、辅助菌接合后，在选择性三抗培养基上产生了一些接合子，而单独的供体菌、辅助菌、受体菌在这样的选择性培养基上均不能生长。将其接种于无氮三抗培养基上，接合子可生长，单独的供体菌、辅助菌、受体菌不生长。用无选择压力的液体ｌｂ培养基传20代后，在三抗ｌｂ培养基上筛选稳定的接合子，此时在ｚｅｉｓｓ荧光显微镜蓝色激发光下明显看到每个单菌落发出明亮的荧光。挑取ｇｆｐ稳定表达的接合子单菌落液体培养后取菌液，ｐｃｒ扩增ｇｆｐ片段，琼脂糖凝胶电泳结果见图３。从图3可以看出，经ｐｃｒ扩增后，ｈａｕｍ１０－