基因功能研究

基因功能研究王光明临床医学院病理科DNA水平RNA水平蛋白质水平DNA测序基因芯片实时定量PCR原位杂交Southernblotting基因敲除和转基因RNA测序RNA芯片定性、定量PCR原位杂交Northernblotting基因沉默蛋白质测序蛋白质芯片免疫组化、免疫荧光、免疫印迹酶活性免疫共沉淀蛋白质晶体结构免疫共沉淀EMSASuper-EMSAPromoter分析DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制基因表达(geneexpression)--基因转录及翻译的过程。•rRNA、tRNA的合成属于基因表达中心法则：核酸分子杂交技术概念•分子杂交（hybridization）：有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补配对形成稳定的双链分子的过程。•印迹（blotting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体支持物上的过程。•探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或者RNA片段种类•固相杂交（solid-phasehybridization）是将变性的DNA固定在固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交•液相杂交（solutionhybridization）指使变性的待测核酸单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使之形成杂交复合物•DNA与DNA杂交•RNA与RNA杂交•DNA与RNA杂交几种常见的杂交•分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。•根据被检测的对象，分子杂交可以分为：•Southern杂交：检测DNA，探针为DNA或者RNA•Northern杂交：检测RNA，探针为DNA或者RNA3.分类（常用分子杂交技术）1969，Insituhybridization（ISH）1975，Southern，Southernblotting:DNA印记1977，Alwine，Northernblotting：RNA印记1979，Towbin，Westernblotting：蛋白质印记基因芯片复性RNADNA•影响Southern杂交能否检出杂交信号的因素•1、目的DNA在总DNA中所占的比例•2、探针的大小和比活性•3、转移到滤膜上的DNA的量•4、探针与目的DNA的配对情况（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA酶切硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段放射自显影或成像电泳印记转移（转膜）Southern实验步骤示意图Southern的应用检测样品中的DNA插入的拷贝数，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。Sourthern杂交分析转基因拷贝数Northernblotting1发展J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Sourthern杂交技术十分类似，所以叫做Northernblotting。Northern的应用检测样品中是否有基因的转录产物及其含量。SBEIIIWTSBEIIIOXWTSBEIIIOX3检测基因的表达水平---Northern的应用实例三种分子杂交技术的比较SouthernNorthernWestern原位杂交(insituhybridization)•将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。•特点–能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究–不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高–能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态核酸原位杂交的基本步骤•A.细胞或组织的原位杂交检测特异mRNA是否存在。步骤：细胞或组织的固定后置于载玻片上组织细胞杂交前的预处理–用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记杂交杂交结果检测菌落原位杂交•对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时采用。B.菌落或噬菌斑的原位杂交：构建基因文库时，菌落或噬菌斑转移到NC膜上进行杂交斑点杂交•将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。生物芯片1概念采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray芯片种类按固定分子：基因芯片(GeneChip)蛋白质芯片(ProteinChip)细胞（组织）芯片（Cell/tissueChip）根据用途信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。芯片特点优点：①微型化：平方厘米大小，实验所需试剂用量少②高通量：一次检测数万个分子③自动化④标准化：传统方法检测众多基因要经历多次实验，因而每次实验之间是存在系统误差的。缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同。生物芯片的应用①基因表达水平的检测②基因诊断③药物筛选④个体化医疗⑤测序⑥生物信息学研究1.芯片制备2.样品制备3.分子杂交4.检测分析（二）芯片分析基本流程1生物芯片的制作玻璃片（最常用的材料）聚丙烯酰胺板金属片硅片1.1载体的材料1.2芯片的制作方法基因芯片的制作方式原位合成直接点样提取DNA或RNA，PCR或RT-PCR扩增，掺入荧光染料标记。与Northern和Southern杂交的区别：样品标记而不是探针标记2样品的制备样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。与经典分子杂交的区别：1.杂交时间短，30分钟内完成2.可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素：盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构3杂交过程类似于一般的杂交法。1)hybridizeApplysample2)rinse4检测分析1.激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光2.激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号3.软件进行进行图象分析和数据处理4检测分析Laser1Laser2Detector1Detector2Scanner芯片的扫描5.图像处理Detector1Detector2False-colordifferentialimage图像分析基因芯片应用基因表达谱（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation红色上调黄色不变绿色下调•生物芯片（biochip）的概念指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。DNAChipTechnology•Solidsupport(glass,plastic,metal,silicon)•MiniaturizedarrayofDNA(geneticmaterial)•WorkonthebiochemicalprincipleofDNA/DNAhybridization•Hybridizedprobes(DNAmolecules)arefluorescentlylabeled•生物芯片的主要特点：高通量、微型化和自动化•生物芯片的分类：基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室1.基因芯片（Genechip）又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。2.蛋白质芯片(proteinchip)利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。•3.芯片实验室(labs-on-chip)–高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统–实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化–芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标•DNA芯片技术包括四个主要步骤–芯片的设计与制备–样品制备–杂交反应和信号检测–结果分析基因芯片流程样品制备芯片制备杂交杂交信号检测数据分析基因芯片技术在医学中的应用•基因表达分析•基因型、基因突变和多态性分析•疾病诊断：遗传性、感染性、肿瘤•药物筛选•指导医院及治疗方案•预防医学•蛋白质芯片（proteinchip）•又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。根据制作方法和应用的不同，蛋白质芯片分为两种:–蛋白质功能芯片细胞中的每一种蛋白质占据芯片上一个确定的点，主要是高度平行地检测天然蛋白质活性。–蛋白质检测芯片将能够识别复杂生物溶液（如细胞提取液）中靶多肽的高度特异性配体进行点阵，这种芯片能够高度并行的检测生物样品中的蛋白质。•蛋白质芯片技术在医学中的应用–1.特异性抗原抗体的检测–2.生化反应的检测–3.疾病诊断–4.疾病分子机制的研究–5.药物筛选及新药的研制开发基因表达谱（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation红色上调黄色不变绿色下调基因芯片的应用1基因表达分析：分析基因表达时空特征检测基因差异表达发现新基因大规模测序2基因型、基因突变和多态性分析分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系3疾病的诊断与治疗遗传病相关基因的定位:产前筛查与诊断肿瘤诊断感染性疾病的诊断4药物研究中的应用新药开发发现药物的新功能调查药物处理细胞后基因的表达情况对药物进行毒性评价5基因芯片在中医学领域中的应用药物筛选中医“证”本质的研究针灸原理研究6其它应用环境化学毒物的筛选体质医学的研究基因启动子转录调控因子的结合位点PPARRXRPPARbindingsiteSOD3promotorsequenceCo-activators基因检测•1、常规PCR（定性或者半定量）•2、定量PCR：Real-timePCR•1）反应体系中含有SYBRGreenI荧光染料•2）标记特异的探针：TaqMan探针常规PCR与定量PCR的比较常规PCR定量PCR反应方式2步法3步法2步法3步法反应液成分dNTP，引物，模板，酶dNTP，引物，模板，酶，探针，参照结果检测琼脂糖凝胶电泳ELISA，或实时荧光检测结果性质定性定量，或定性结果准确性无法区别假阳性假阴性有效识别假阳性假阳性——外标准方法•在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列稀释的已知标准（通常为质粒DNA）•如果在该标准稀释系列范围内，扩增产物/模板成线性相关，则可推导出同时扩增的待测样本中PCR模板的相对量——外标准方法定量PCR——外标准方法•优点：–方法简便，容易建立–使用双孔重复测定•可得到非常准确的结果•甚至可排除管间的差异•不能排除样本间的差异定量PCR——外标准方法•缺点•PCR反应体系的微小区别也会对测定造成较大的影响•在扩增效率上的差异，会使定量测定精密度和重复性不佳•操作麻烦荧光检测法•原理•荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。•在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数•根据所使用的技术不同，荧光定量