食品级酿酒酵母高效分泌展示表达系统构建

浙江大学生物系统工程与食品科学学院博士学位论文食品级酿酒酵母高效分泌/展示表达系统构建姓名：郭钦申请学位级别：博士专业：食品安全指导教师：何国庆20090915食品级酿酒酵母高效分泌/展示表达系统构建作者：郭钦学位授予单位：浙江大学生物系统工程与食品科学学院相似文献(10条)1.会议论文张小里.夏诏杰.贾志华.赵彬侠营养物震荡高密度培养提高重组酿酒酵母质粒稳定性和外源蛋白质产量2002表达外源α-淀粉酶的重组酿酒酵母菌株在生长静止期表现出质粒稳定性增加的趋势,当培养过程中脉冲流加天然氮源酵母膏形成其浓度震荡时这一现象得到重现,恒流量流加营养物结合酵母膏浓度震荡的高密度培养方案使质粒保持率稳定在90﹪以上,最大菌体密度、最大α-淀粉酶活力分别达到36.4g/L和207.6U/mL.2.期刊论文丁新丽.汪天虹.张光涛.卢翌.DINGXin-li.WANGTian-hong.ZHANGGuang-tao.LUYi瑞氏木霉纤维素酶基因在酿酒酵母中的表达研究-酿酒科技2005,(9)从瑞氏木霉(Trichodermareesei)cDNA文库中克隆到外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ(CBHI)cDNA基因,将该基因分别连接到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达载体pAJ401和pVT100_U上,构建了重组质粒pAJ401-cbh1和pVT100_U-cbh1.分别电转化2个重组质粒转移至酿酒酵母H158中,得到重组酵母HPC和HAC,实现了CBHI的分泌型表达.再将质粒pAJ401-cbh1转入已含有瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ基因egl的重组酵母H1m中,构建了同时表达cbh1和eg1的重组酵母菌株HMEPC.比较HMEPC和H1m对纤维素底物的降解,前者滤纸酶活比后者提高14.3%,表明CBHI与EGI对滤纸降解有协同作用.3.学位论文汪宗桂酿酒酵母hGH克隆和消化道转基因研究2004人生长激素(hGH)是一种单链多肽激素,它由191个氨基酸组成,主要经人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌.人生长激素具有广泛的生理功能,在生物制药领域具有十分重要的地位.将酿酒酵母作为基因运送载体,研究和探索经消化道途径基因治疗具有重要的理论意义.消化道基因治疗具有方便、安全等特点,市场前景巨大.该研究主要进行人生长激素在酿酒酵母中的克隆以及该重组酵母消化道转基因过程的研究.首先利用ECHO克隆系统,构建两种以酿酒酵母为宿主菌的附加型重组质粒,即pYES-hGH酿酒酵母表达载体和pESC-CMV-hGH酵母-哺乳动物穿梭载体.通过酶切鉴定、菌落PCR分析,对重组载体上的外源基因片段进行测序并分析,证明人生长激素基因及相关序列已经成功克隆到表达载体.采用常规醋酸锂转化法把重组表达载体转化到酿酒酵母中,利用营养缺陷型选择培养基及菌落PCR法筛选重组转化子.对重组酵母进行特性研究,发现重组酵母的质粒稳定性很高,其生长曲线呈典型的反S型生长,且两种重组酵母的生长规律相差不大.携带pYES-hGH酿酒酵母表达载体的重组酵母经不同时间的诱导表达,机械破壁后进行SDS-PAGE电泳分析,发现16小时的诱导时间可产生最大的hGH表达量.把16小时诱导表达产物经Westernblot分析,证明表达产物确为人生长激素.把构建的两种重组酵母(携带酿酒酵母表达质粒的重组酵母和携带酵母-哺乳动物穿梭质粒的重组酵母)细胞通过小鼠灌胃进行免疫实验,检测免疫小鼠体内血清中的hGH抗体.利用酿酒酵母诱导表达的hGH蛋白作为抗原,经ELISA分析发现,小鼠血清中确实有hGH抗体的产生,初步说明hGH基因经酿酒酵母的携带,已通过消化道途径进入小鼠的体内.4.期刊论文徐勇.陈英.勇强.黄敏仁.余世袁.XUYong.CHENYing.YONGQiang.HUANGMin-ren.YUShi-yuan重组酿酒酵母的木糖发酵性能研究-林产化学与工业2008,28(1)利用聚合酶链式反应(PCR)技术从毕赤树干酵母的基因组中扩增得到木糖还原酶基因xyl1和木糖醇脱氢酶基因xyl2,它们分别或同时与高拷贝型酵母表达载体YEp24重组,再经醋酸锂转化酿酒酵母,得到了3种不同类型的重组酵母菌株,其中重组酿酒酵母菌株NLR04可利用单一的木糖为碳源进行生长,并能够在微氧或厌氧环境中缓慢发酵木糖生成乙醇,乙醇得率可达到理论得率的37.0%.该研究可为微生物的木糖代谢工程提供种质资源.检测结果表明,与毕赤树干酵母不同,在重组酿酒酵母中木糖还原酶基因以组成型表达,而木糖醇脱氢酶基因在某种程序上受木糖的诱导.与毕赤树干酵母相比,重组酿酒酵母菌株中的木糖醇脱氢酶的比活力明显较低,这说明在ScNLR04中该基因的表达存在某些抑制作用,这一缺陷可能是重组酵母菌株发酵木糖的瓶颈之一.5.学位论文唐语谦酿酒酵母表面展示人自身免疫性肝病抗原及其应用研究2008酵母表面展示体系能够展示糖基化和二硫键异构化等修饰的真核蛋白,蛋白在酵母细胞表层可直接利用流式细胞仪检测,进行活性分选,通过一步离心即可分离获得表达的蛋白,易实现高通量筛选。酵母表面展示体系已经成功的应用于筛选抗体、抗体酶和其他生物因子,但稳定的蛋白表面展示还受到多种因素的影响。目前,自身免疫性疾病(AID)的诊断和治疗均需要高效价的自身抗体和抗体药物,而检测和分析AID的自身抗体有助于免疫病理机制研究。而现有的抗体检测和抗体制备方法均离不开高纯度的抗原,有限的获得方法和复杂的操作过程影响了抗体的生产和应用。基于对抗体生产的需求和研究人自身免疫性肝病的重要性,本论文从HumanFetalLiverCreatorSMARTcDNALibrary中扩增了7个人自身免疫性肝病相关抗原的基因,插入带His.tag标签的酵母表面展示载体pICAS-H中,获得7个重组质粒,在Genbank的人源基因组数据库中通过BLAST比对重组质粒的测序结果,发现克隆基因与同源性最高序列的最大相似度均在99％以上；再将重组表面展示载体整合到酿酒酵母宿主MT8-1的基因组上,构建了表面展示人自身免疫性肝病抗原的7株重组酵母菌。分别诱导培养7株重组酵母菌,用免疫荧光染色,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测,证明克隆的7个抗原蛋白均成功展示于酵母表面；展示抗原GSTAl和ProI的重组酵母整体细胞呈现高效表达,展示抗原AGSPR1、BIR5、G2CB1、CK8和PSA6的重组酵母部分细胞呈现高效表达。从7株重组酵母菌的培养情况发现,重组质粒的导入对宿主菌的生长规律没有太大影响,外源基因的导入与表达对细胞的生长没有带来根本性的改变。用YPD、SD和SA培养重组酵母,发现在对数生长末期(24h)重组酵母展示目的抗原的表达率最高,而且用SA培养基培养重组酵母获得抗原的展示表达率高于另外两种培养基培养。优化培养基成分后发现相对大部分展示抗原的重组酵母而言,选取含3％的酸水解干酪素和2％的葡萄糖的SA培养基培养,可获得较高的展示表达率。用酵母表达谱基因芯片在转录水平上研究外源基因的插入及不同培养条件对酿酒酵母基因表达的影响,发现外源基因的插入后上调最明显的基因为SAG1和TRP1,还有参与细胞壁合成、胞内蛋白的合成、液泡融合和能量合成等基因,而下调基因主要集中在线粒体的合成与代谢、糖类合成、氨基酸合成与代谢、物质运输、动态调节等生物过程。不同培养条件下产生的差异基因主要参与蛋白质合成、新陈代谢、能量合成、胞内运输、代谢调节和辅助调节蛋白功能等生物学过程。培养基SD培养中蛋白质合成和新陈代谢相关基因出现上调,蛋白质修饰、折叠相关基因出现下调。差异表达基因主要集中于糖酵解、戊糖途径、TCA循环、氨基酸合成与脂肪酸代谢等途径。糖酵解途径受培养基SD与SA的培养影响明显的基因不多,戊糖循环途径和TCA循环在SA培养中明显上调,TCA循环在SD培养中呈现下调。通过建立新的免疫荧光法和Yeast-ELISA的方法将酵母展示抗原颗粒CK8、PSA6和AGSPR1抗原成功应用于单抗和多抗的检测；并进一步用重组酵母展示的ProfilinⅠ抗原检测杂交瘤细胞培养上清和腹水中的对应抗体,筛选阳性杂交瘤细胞株,获得了2株可生产ProfilinⅠ特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结合DNA免疫技术,证明了无蛋白抗原制备抗体方法的可行性。本研究通过构建7株展示人自身免疫性肝病抗原的重组酵母,获得优化的稳定表达条件,建立了一个稳定、快速的酵母表面展示抗原的技术平台,并成功应用其中的几种酵母展示抗原替代传统的蛋白抗原,进行抗体检测和抗体筛选。利用酵母表达谱基因芯片分析外源蛋白插入和培养条件对酿酒酵母基因表达的影响,对进一步从转录水平上优化表达具有重要意义。6.期刊论文王青艳.杨登峰.孙靓.陆雁.黄日波.WANGQing-yan.YANGDeng-feng.SUNLiang.LUYan.HUANGRi-bo酿酒酵母中的嗜热细菌木糖异构酶活性表达及木糖代谢研究-广西科学2009,16(4)将来自嗜热放线细菌Thermobifidafusca的木糖异构酶(xyloseisomerase,XI)基因xylA,连接于酵母表达载体pYES2的半乳糖诱导启动子(PGAL)下,得到重组质粒pYES2-xylA,用其转化酵母菌INVSc1,测定重组酵母菌株INVSc1-xylA的木糖异构酶活性,并对重组酵母菌株进行木糖葡萄糖共发酵试验,探讨在酿酒酵母中建立新的生产乙醇木糖代射途径.结果木糖异构酶在75℃,pH值6.8的酶活力最高,在酿酒酵母中成功地获得活性表达,并且SDS-PAGE电泳有明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD.INVSc1-xylA在木糖葡萄糖共发酵实验中消耗木糖和产生乙醇分别比对照菌提高53.8%和36%,提高了其生产乙醇的能力.7.学位论文向柱方金黄色葡萄球菌蛋白A与HIV-1gp41的酿酒酵母表面展示及应用2008酵母表面展示技术在各种功能蛋白质的展示与应用研究中取得很大的进展,将功能蛋白展示在酵母细胞表面,在抗体筛选、制备和检测中得到了应用。艾滋病(AIDS,acquiredimmunodeficiencysyndrome)在全球蔓延,艾滋病的检测和预防关乎人类的健康。HIV囊膜蛋白gp41的核心区域为六桶状结构,是相对保守的-段蛋白,将gp41N端片段(aa534-678,包括核心区域)展示于酵母细胞表面,不用分离纯化,可直接应用于检测血清中的抗gp41抗体。研究中将gp41N端抗原蛋白分别与his标签和flag标签融合表达,并展示到酿酒酵母细胞表面。以pMD18T-gp41重组质粒作为模板,获得目的基因gp41,将基因片段插入到带有标签的载体pICAS-his以及pICAS-flag中,构建gp41酵母表面展示载体。测序结果表明gp41基因正确插入到载体中,与Genebank登录号为U08458(gi：475667)中的gp41序列有96％的同源性,此序列为HIV-1E亚型。翻译后的蛋白序列与U08458的蛋白序列(AAB04093)比对,有8处不一样,同源性为94％。酵母表面展示载体携带外源基因整合至酿酒酵母基因组中,分别构建了重组酵母MT8-1/pICAS,MT8-1/pICAS-his,MT8-1/pICAS-flag,MT8-1/pICAS-his-gp41及MT8-1/pICAS-flag-gp41。在葡萄糖诱导下,使抗原蛋白展示表达。为了检测蛋白的表面展示,采用免疫荧光染色的方法进行染色分析。荧光显微镜观察及流式细胞仪检测结果表明His标签以及flag标签均展示在酵母细胞表面；在MT8-1/pICAS-his-gp41表面可以检测到gp41的成功表达,但是MT8-1/piCAS-flag-gp41表面却不能检测到。选择不同的培养基对重组酵母进行表达优化。当SD-W培养基中葡萄糖浓度为1％,2％时,分别有82.46％和63.64％的细胞表达gp41抗原。以此展示有抗原gp41的酵母建立细胞ELISA检测抗体。在检测溶液中的单克隆抗时,最低检测浓度可达到1ng/mL;应用于多克隆抗体检测,当菌体数量为