生化分离技术及应用课件PDF版

第九章生化分离技术及应用本章重点主要纯化方法（分配层析，吸附层析，凝胶过滤层析，离子交换层析，亲和层析，疏水层析，不连续PAGE，SDS-PAGE，等电点聚焦，双向电泳）的原理？蛋白质分离基于蛋白质的哪些性质？蛋白质分离纯化一般原则大概能够针对蛋白质的性质的差异设计相应的实验方案对蛋白质进行分离台式高、超速离心机0.6-10万转/分离心机制备型分析型分析性超速离心机普通离心机冰冻离心机台式（或地面式）普通离心机大容量冰冻离心机小于0.6万转/分高速冰冻离心机0.6-2.5万超速冰冻离心机2.5-8万或更高㈠种类一离心机(分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等)⒈普通制备型离心机分离、浓缩、提纯样品中，固液分离。⑴台式或地面式普通离心机低、中速离心机，转速在3000—6000rpm，这类离心机可用于收集易沉降的大颗粒（如红血球、酵母细胞以及组织块等）。⑵台式高、超速离心机转速0.6-10万转/分或更高。这类离心机可用于收集不易沉降的细胞器、膜等小颗粒。因此需要有冷却离心腔的致冷设备，一般温度控制在0—4℃，速度控制准确；可用于收集微生物、细胞碎片、大细胞器、免疫沉降物等，病毒、小细胞器（如核糖体）、蛋白质等大分子。⑴大容量冰冻离心机，小于0.6万转/分⒉制备型冰冻离心机⑵高速冰冻离心机，0.6-2.5万⑶超速冰冻离心机，2.5-8万或更高⒊分析型超速离心机XL-A分析型超速离心机主要技术指标：检测波长范围200nm-800nm转子最大转速40000RPM⑴沉降系数（s）：指单位离心力作用下颗粒沉降的速度。蛋白质，核酸，核糖体，病毒等的沉降系数介于1-200×10-13的范围。为方便起见，把10-13秒作为一个单位，用S表示，1S单位等于1×10-13秒。⑵沉降速度：是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。颗粒沉降的时间和速度取决于：离心力、颗粒的大小形状和密度、沉降介质的密度和黏度。(二)相关概念㈢离心技术类型差速离心法和密度梯度离心法（速率区带离心、等密度离心）⒈差速离心法原理：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。常用于从组织匀浆中分离细胞和病毒。沉淀(细胞膜碎片、线粒体、溶酶体)已破碎的细胞500g,10’沉淀(细胞核)上清液10000g,10’上清液100000g,3h沉淀(核糖核蛋白体)上清液(可溶性组分)⒉速率—区带离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法介质梯度应预先形成可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分⒊等密度梯度离心原理：不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。此法常用CsCl、等做介质,一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。二、层析㈠、概述•层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。•后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。•1944年出现纸层析，以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。⒈层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数、极性、带电量等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。⒉层析法的分类⑴按层析过程的机理分类•吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。•疏水层析：利用不同组分与基质疏水相互作用不同，使之分离。•离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂结合力的不同。•凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分排阻作用的不同。•亲和层析：利用物质间的特异性亲和力分离特定物质。⑵按两相所处的状态分类流动相有两种状态：*液体作为流动相*气体作为流动相固定相也有两种状态：*固体吸附剂作为固定相*以吸附在固体上的液体作为固定相液-固层析液-液层析气-固层析气-液层析液相层析气相层析⑶按操作形式不同分类柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定㈡、分配层析技术⒈原理：液-液层析法层析系统由两相组成：固定相、流动相。分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。固定相/流动相K=c1/c2利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。2791186320.256.750.2520.252.256.756.750.7520.2520.256.750.256.752.250.756.754121236271186931648412361216161616323216161616881616886432328881616841212412124414532AB412412121244281221288822=16448161453215.220.23.40.0610.10.752.256.85.10.19AB=3AABCDE64323216321688242444162416层析柱分离物质的示意图：644816424361927270.27313.52720.3XY某一物质在一定量的溶剂系统中分配，转移次数越多其分配分溶曲线越集中，峰形窄而高，有利于混合物中各物质的分离。不同组分的含量不同组分在柱中的位置上部中部下部不同物质分配系数不同时：分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开⒉分配柱层析在层析柱中加上亲水性不溶物质叫支持物如纤维素、淀粉、硅胶等。固体支持物有亲水性的特点，吸附上一层不流动的结合水作为固定相，沿固定相流动的与之不相容的溶剂（苯酚、正丁醇等）是流动相。⒊分配纸层析纤维素吸附的水是固定相，展层用的有机溶剂是流动相层析时混合氨基酸在这两相中不断分配，使他们分布在滤纸的不同位置上。此项技术可用于氨基酸成分的定量定性测定。操作：点样→展层→显色用茚三酮显色时，得到一个滤纸层析谱。定义：原点到氨基酸停留点的距离与原点至溶剂前沿之比称为Rf值。只要把溶剂系统、温度、滤纸型号等条件确定，则每一种氨基酸的Rf值是一个确定值。⒋分配薄层层析㈢、吸附层析技术吸附层析法（液-固色谱法）⒈原理：利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。特点：适合分离不同种类的化合物(醇类和芳香烃）⒉吸附剂种类吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物质的极性官能团作用。常用的吸附剂有活性炭、羟基磷灰石、硅石、氧化铝等⒊羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2],可用于分离蛋白质与核酸。其表面有Ca2+和PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。HA柱层析最重要的用途之一是分离单链DNA和双链DNA，因为它对双链DNA的亲和力大于单链DNA。在水环境中，非极性分子将倾向于彼此结合，以避开水分子蛋白质具有带电和极性氨基酸组成的亲水区域，但同时有一些非极性的氨基酸组成的疏水区域。㈣、疏水作用层析⒈原理非极性氨基酸组成的疏水区域可使蛋白结合非极性分子，这种相互作用可被用作蛋白质疏水作用层析。在不带电荷的载体上偶联疏水基团而形成疏水吸附剂利用载体和样品疏水基团间的疏水相互作用使它们吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水作用，使吸附的蛋白质从吸附剂上解吸下来。2.疏水层析剂OCH2CHCH2O(CH2)3CH3OHOCH2CHCH2O(CH2)7CH3OHOCH2CHCH2OOHButyl丁基琼脂糖Octyl辛基琼脂糖Phenyl苯基琼脂糖⑴蛋白质的疏水性：不同蛋白质的疏水位区和疏水口袋的数目、大小、形状和亲脂性不同(2)蛋白质的环境在水相中提高中性盐的浓度可增强疏水作用，反之减弱3.影响疏水相互作用的因素㈤、凝胶过滤层析技术⒈基本原理又叫（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。⒉凝胶的种类和性质⑴交联葡聚糖凝胶（SephadexG)G后的数字为凝胶吸水值的10倍。反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分离范围。⑵琼脂糖凝胶（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。⑶聚丙烯酰胺（Bio-GelP)一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。床体积（Vt）膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）外水体积（Vo）：凝胶珠孔隙的水相体积内水体积（Vi）:凝胶珠内部的水相体积基质体积（Vm）：基质自身具有的体积洗脱体积（Ve）：自加样开始到该组分的洗脱峰出现时所流出的体积。Vt＝Vo＋Vi＋Vg由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：Vt＝Vo＋Vi⒊术语和概念物质在凝胶层析柱被排阻的范围均在均在0～100％之间，被排阻的程度由可用分配系数Kav表示：Kav:分离化合物在内水和外水体积中的比例关系Kav＝Ve－V0／Vt－V0分离物分子质量大，Kav值小，反之，则增大Kav既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白质分子量的重要依据。(2)Ve=Vo+ViKd=1分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散，最后流出.(1)Ve=VoKd=0分子完全被排阻于凝胶颗粒之外全部分布于流动相里,最先流出。(3)0Kd1Ve=Vo+ViKd•为物质以某种程度向凝胶颗粒内扩散Kd=00＜Kd1Kd=1洗脱体积凝胶过滤法测定相对分子量原理蛋白质分子通过凝胶的洗脱体积取决于它的斯脱克半径；如果未知蛋白与理想的非水化球体有相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与球体相同的的斯脱克半径；因此，实验中只要测得标准蛋白的洗脱体积，再测得未知蛋白的洗脱体积，就可以得到它的相对分子量。㈥、离子交换层析法⒈原理:根据离子间作用力的不同而将物质分离的方法离子交换剂可解离出阴离子或阳离子，当待分离的溶液中含有阳离子时，可以与阳离子交换剂的阳离子交换，吸附在离子交换介质上，带电量不同的物质与离子交换剂的结合力不同，解离的条件不同，可通过改变条件，促使其解离和分部收集待分离物。离子交换剂的构成：纤维素－O-CH2－COO-－Na+基质功能基团反离子阴离子交换剂阳离子交换剂2.离子交换剂的类型支持介质的不同：离子交换树脂离子交换纤维素离子交换葡聚糖离子交换琼脂糖离子类型不同：强酸性弱酸性强碱性弱碱性离子交换剂分类SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration---------------------------------------------------