第八章 酶的定向进化-2013-12-5

酶的改性（enzymicimproving）：通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程。酶改性的技术酶分子的修饰酶固定化酶的非水相催化酶的定向进化……酶分子的定向进化（directedevolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制。4.6.1定向进化的特点适应面广；目的性强；效果显著。4.6.2定向进化的原理以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+定向选择。酶基因随机突变构建突变基因组文库定向筛选4.6.3酶基因的随机突变1、易错PCR技术为代表的无性进化无性突变：向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选。易错PCR：从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。反应条件：提高Mg2+浓度；添加Mn2+；改变四种底物浓度比等。易错PCR技术特点：操作简便，随机突变丰富。缺点：正突变基因少，需多次PCR。注意：控制好基因突变频率。适用：较小基因的定向进化。2、DNA重排技术为代表的有性进化DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR（sexualPCR）。从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA改组原理DNA改组技术特点：正突变频率高，进化速度快。注意：需多次进行。3、基因家族之间的同源重组从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同源重组进化。结果对单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生物来源的天然酶提高270倍，比另外两种酶提高了540倍。1、突变基因文库的构建定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。质量要求：文库包容性和文库完整性过程：载体选择基因重组形成基因文库质粒噬菌体DNA黏粒载体噬菌粒载体转化转导2、突变基因的筛选（1）定向选择环境条件的设定（2）高通量筛选技术平板筛选技术荧光筛选法噬菌体表面展示法酵母细胞表面展示法酶定向进化的应用提高酶的催化效率增加酶的稳定性改变酶的底物特异性