第四章蛋白质的化学修饰

第4章蛋白质的化学修饰化学修饰的原理化学修饰的方法学蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联亲和标记蛋白质化学修饰的应用内容提要化学修饰：凡通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变的现象。选择性化学修饰：肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。第一节化学修饰的原理影响因素蛋白质功能基的反应性修饰剂的反应性一、影响蛋白质功能基反应性的各因素因为大多数蛋白质分子是（亲水的表面，疏水的核），所以pk值和影响pk值的因素应特别关注。（一）微区的极性微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。醋酸的pk值在水中为4.76在80%乙醇中为6.87在100%乙醇中为10.32微区的极性与介质的介电常数有关。（二）氢键效应天然蛋白质或它的离子通过氢键来维持其稳定性，也是使pk值发生改变的一个因素．（三）静电效应研究表明，不同蛋白质中的组氨酸残基的pk值是不同的，原因是由于带电基团相互影响所致。局部极性的变化对色、甲硫、胱氨酸反应性影响最小对酪、半胱氨酸、羧基反应性影响最大对氨基和组氨酸反应性影响较大例如：2-氟酚的pk值比2-溴酚的pk值高0.7pH单位，原因是氟与酚形成氢键的能力比溴强。OHCOHOOHFOHBr水杨酸碳酸酐酶：5.91；6.04；7.00；7.23葡萄球菌核酸酶：5.37；5.71；5.74；6.50（四）位阻效应如果烷基在空间上紧靠功能基，修饰剂不易与功能基反应，出现位阻效应。影响蛋白质中可电离氨基酸侧链的pk值的因素，也是影响侧链基团反应性的重要因素。蛋白质中个别功能基所处的微区不同，反应性也不同，个别功能基的反应性可通过竞争标记法来测定。二、蛋白质功能基的超反应性例如：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，其pk值是：影响功能基pk值基团之间的功能障碍影响功能基反应性的因素多数蛋白质的功能基与简单氨基酸中的同样基团相比，反应性要差。但是，每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂显示出超反应性。影响超反应性的因素：1.改变蛋白质功能基的pk值；2.蛋白质功能基具有较大的亲核性；3.通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向；4.试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性；5.试剂的结合。超反应性可由上述一个或几个因素的综合作用而产生。超反应性：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。三、修饰剂反应性的决定因素蛋白质的构象和表面特性对氨基酸侧链的反应性有影响，同样，它们也可能对接近功能基的修饰剂产生有利或不利的影响。木瓜蛋白酶中的19个酪氨酸残基，只有一个能与修饰剂反应，修饰后酶活性并不改变，说明什麽？（一）选择吸附化学修饰前，修饰剂根据各自的特点，选择性地吸附在低或高极性区，根据对速度的饱和效应，可检测出蛋白质-修饰剂复合物的形成。（二）静电相互作用带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。静电排斥力能抑制修饰作用。（三）位阻因素蛋白质表面的位阻因素，或者底物、辅助因子、抑制剂所产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。D-氨基酸氧化酶的巯基与N-烷基马来酰亚胺的反应，巯基的辛基化速度比乙基化速度快15倍。核糖核酸酶第12号组氨酸烷化α-溴代丁酸反应很快；α-溴代戊酸反应很慢；α-溴代己酸不能反应。（四）催化因素修饰部位附近的其它功能基，如果起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。不同的修饰剂，反应速度和反应部位有明显差异。（五）局部环境的极性溶剂效应是复杂的。有些有机反应的速度与溶剂的极性有关，有些反应则与极性无关。反应类型降低极性对速度的影响⑴RSR+ICH2CONH2→[R2S+CH2CONH2]I-溶剂极性对反应速度的影响适当降低或大大降低没有影响没有影响适当增加或大大增加⑵RSR+H2O2→R2SO+H2O⑶RS-+ICH2CONH2→RSCH2CONH2+I-⑷RNH3++OCN-→RNHCONH2胰凝乳蛋白酶活性中心丝氨酸的乙酰化硝基苯乙酸盐反应强苯乙酸盐反应弱疏水环境阻止产物中电荷分离的反应加速电荷中和的反应第二节化学修饰的方法学一、修饰反应专一性的控制（一）试剂的选择选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。反应类型⑴反应类型⑷对于没有电荷分离和电荷只是从一个离子转移到另一个离子的反应，则介质的极性不重要。对氨基的修饰修饰所有氨基，而不修饰其它基团;仅修饰α-氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基，以及修饰有催化活性的氨基等。修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件来控制。选择蛋白质修饰剂要考虑：修饰反应要完成到什么程度；对个别氨基酸残基是否专一；在反应条件下，修饰反应有没有限度；修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生物；反应是否需要可逆；是否适合于建立快速、方便的分析方法。如果修饰的目的是改变蛋白质的带电状况或溶解性，必须选择能引入最大电荷量的试剂。如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质中反应，则应选择在水中有一定溶解性的试剂。还必须考虑，反应生成物容易进行定量测定；试剂的体积小一些为宜。用于修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备的特征：选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性的条件下进行；标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来进行鉴定；反应的程度能用简单的方法测定。（二）反应条件的选择条件不造成蛋白质的不可逆变性有利于专一性修饰蛋白质（三）反应的专一性若修饰剂专一性较差，除控制反应条件外，可利用其它途径实现修饰的专一性。1.利用蛋白质分子中，某些基团的特殊活性蛋白质，特殊的空间结构，能影响某些基团的活性位置专一性：在蛋白质分子中特别活泼的基团，在适当条件下只是其本身发生作用，而其它基团皆不作用。2.选择不同的反应pH蛋白质分子中各功能基的解离常数是不同的，所以控制不同的反应pH，也就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性。碘乙酸对蛋白质进行修饰，试剂可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及α-氨基、ε-氨基发生作用。当反应pH=6时，只专一地与组氨酸的咪唑基作用。当反应pH=3时，只专一地与甲硫氨酸的侧链作用。在酸性pH下，比较活泼的巯基和氨基，以带质子形式存在，变成不活泼状态。ICH2COO-+蛋白质—SHpH﹥7蛋白质—S—CH2COO-+H++I-ICH2COO-+蛋白质—SCH3pH﹥2蛋白质—S—CH2COO-+I-CH3ICH2COO-+蛋白质—NH2pH﹥8.5蛋白质—NH—CH2COO-+H++I-ICH2COO-NHN+蛋白质pH﹥5.5NCH2COO-N蛋白质+H++I-3.利用某些产物的不稳定性在高pH下，氰酸、二硫化碳等可把氨基转变成脲和脲的衍生物。但因pH高，巯基与试剂反应的产物迅速被分解。4.亲和标记亲和标记试剂除了能与蛋白质作用外，还要求试剂的结构和与蛋白质作用的底物或抑制剂相似。5.差别标记在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用。然后将过量的底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制剂保护的基团是带放射性同位素标记的。6.利用蛋白质状态的差异在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。二、修饰程度和修饰部位的测定最常使用的是间接法。三、化学修饰结果的解释（一）蛋白质功能改变的解释在确证试剂已经作用于蛋白质的基础上，除验证修饰蛋白质在溶液中的构象是否发生变化外，还要证明修饰作用是否发生在活性部位上。常用方法：1.如果修饰发生在活性部位或必需基团上，则蛋白质活性的丧失于修饰程度一定成某种化学计量关系，而且底物必然能降低修饰蛋白质的失活程度，而与活性部位不能结合的分子则没有这种影响。2.当采用可逆保护试剂时，修饰失活的蛋白质随保护基的去除可重新恢复活力，而且恢复程度应与保护基去除量成一定比例关系。修饰剂也可修饰远离活性部位的氨基酸，使蛋白质构象发生改变，造成蛋白质活力丧失。引入带电或庞大基团时易出现这种情况。(二）修饰残基的不稳定性原始修饰以后，还可能发生共价改变。如酰基转移、巯基转移、卤素转移及二硫交换过程可能自发地或在纯化、降解过程中发生。（三）没有被发现的修饰咪唑基、巯基、羧基等在反应条件下不稳定或在以后的纯化中被水解，因而检测不出。有些修饰反应不能检测出来，是由于它们在蛋白质化学中不占优势。第三节蛋白质侧链的修饰一、氨基的修饰氨基修饰引入正电荷的修饰引入负电荷的修饰电荷消失的修饰（一）引入正电荷的修饰下列试剂修饰赖氨酸后，可在赖氨酸侧链上留下可电离的带正电基团。1.还原烷基化ENZ—NH2+RHCO-H2O+H2OENZ—N=CHRENZ—NH—CH2R[H]希夫碱所用的醛有不同R基醛2.用甲基乙亚酰胺脒化H2NROCRENZ—NH2CRNH2ENZ—NHROH++pH﹥8.5（二）消除电荷的修饰这类试剂可抑制赖氨酸的ε-NH2的质子化，使形成的衍生物不带电。ENZ—NH21.乙酰化OCCCH3CH3OOpH﹥7+CCH3OENZ—NHCH3COO-+H++2.甲氨酰化作用ENZ—NH2+HNCOpH=7COENZ—NHNH2+HNCO+H2OENZ—S-副反应：CONH2ENZ—S+OH-pH6～8甲基乙亚酰胺醋酸酐氰酸盐巯基优点是氰酸盐离子体积小ENZO-+HNCO+H2OpH﹥5COOENZNH2+OH-COENZO-+HNCO+H2OpH=5CCOOENZNH2+OH-OENZ+HNCONHNpH=8CENZNH2ONHN3.芳基化三硝基苯磺酸（TNBS）与氨基作用，产生三硝基苯衍生物，反应产物为黄色。TNBS也能与巯基作用。SO3HNO2NO2NO2NH2R+pH﹥7+H+NHR+SO3HNO2NO2NO2酚基羧基咪唑基TNBS（黄色）（三）引入负电荷的修饰1.乙酰化ENZ—NH2OCCOOCH2CH2pH﹥7NHOH+ENZCCOOCH2CH2++此反应类似于醋酸酐与氨基的反应，但酸酐所带的负电荷全部引入到侧链上。琥珀酸酐和苯四酸酐都可用于将负电荷引入到赖氨酸侧链上，但用苯四酸酐引入的负电荷多。修饰产物在低pH下保温24小时，可使蛋白质活力完全恢复。琥珀酸酐2.磷酸吡哆醛修饰赖氨酸残基在中性pH下与磷酸吡哆醛（PLP）反应，形成希夫碱，再用硼氢化钠还原，得赖氨酸的不可逆衍生物。ENZ—NH2OHCH2OPO3H-NHCH3OC+-H2O+H2OENZ—HCH2OPO3H-NHCH3OCNNaBH4ENZ—CH2NHOPO3H-NHCH3OCH2PLP二、精氨酸胍基的修饰具有两个临位羰基的化合物能与精氨酸胍基形成稳定的杂环产物。常用试剂有：丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛。产物不可逆，在325nm处有吸收，可用于定量测定。CENZCH2NHNH2NH2COHCO+2COCENZHCH2NHHCONNCCOHA苯甲酰甲醛pH7.825℃+H2OBCENZNHNH2NH2CHCHOO+乙二醛CENZNHCHCHNN+2H2OCCENZNHNH2NH2COOCRR+CCENZHHNCONNRRHOHCCENZHONCNNRRH丁二酮