PCR技术及肿瘤三项介绍

PCR技术及肿瘤三项应用主讲人：赵晶晶2015.7.31PCR•PCR的基本原理变性,复性,半保留复制•PCR三步曲变性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右聚合酶链式反应：是一种放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。循环次数DNA的链数121222243238102101024202201,048,576302301,073,741,82410亿PCR循环次数与DNA产量关系PCR特点：高效扩增、忠实复制实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。实现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强，能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。荧光定量PCR的临床应用感染性疾病的诊断母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断肿瘤的诊断法医学鉴定个体化用药指导年龄老年，儿童，新生儿性别体重/身高合并症病程器官功能肝脏,肾脏,心脏基因型遗传（占70%）环境因素食物/吸烟/合并用药药物反应7预警遗传相关疾病疾病相关遗传缺损药物基因组学关联分析药物相关遗传缺损预防个体化治疗HGP启动了个体化医学/基因组医学治疗方法开发•基因治疗•药物治疗人基因数：~22,000潜在药靶：~22,000现有药靶：~5008个体化药物治疗的目的避免药物不良反应最大化药物效应选择有效个体EGFR基因突变检测KRAS基因突变检测BRAF基因突变检测二氢嘧啶脱氧酶（DPD）基因突变检测UGT1A1基因多态性检测PCR技术在肿瘤个性化治疗中的应用肺癌居于我国恶性肿瘤死亡率之首，每年新增60万患者，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占85%。•EGFR表皮生长因子受体;是上皮生长因子细胞增值和信号传导的受体；与肿瘤细胞的增殖，血管生成，肿瘤侵袭，转移及细胞凋亡抑制有关。•KRAS鼠类肉瘤病毒癌基因；是细胞信号内传导途径中的一种信号传导蛋白；像是体内的一个开关，正常时可以抑制肿瘤细胞生长，一旦突变，就会刺激细胞生长，打乱规律，从而导致肿瘤的发生。•BRAF是一种癌基因，是EGFR通路中的重要转导因子，参与调控细胞生长，分化和凋亡等多种生理过程。肿瘤三项12TKTK细胞存活(抗细胞凋亡)PI3-KSTAT3AKTPTENMEK基因转录MAPK细胞增殖/分化化疗/放疗抵抗血管增生肿瘤细胞迁移扩散pYpYRASRAFSOSGRB2pYG1SMG2非小细胞肺癌(NSCLC)组织中EGFR高表达；EGFR对肿瘤的增殖、分化、迁移等起重要作用抑制EGFR活性可阻断下游的信号传导，抑制肿瘤细胞生长、转移和血管增生，促进肿瘤细胞凋亡表皮生长因子受体（EGFR）用于检测肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤患者肿瘤组织EGFR（表皮生长因子受体）基因的突变情况。EGFR突变检测可协助医生选择易瑞沙（Iressa，Gefitinib，吉非替尼)、特罗凯（Tarceva，它赛瓦；Erlotinib，厄洛替尼）等靶向药物的有效人群。EGFR突变的患者建议使用该类药物治疗，无突变者不建议使用该类靶向药物。EGFR基因突变检测是NSCLC靶向用药的必检项目K-ras基因是编码一个GTP结合蛋白的癌基因，其表达产物是EGFR信号传导通路上的重要蛋白。K-ras基因突变一般会使结直肠癌和肺癌患者络氨酸激酶抑制剂产生耐药。–判断肿瘤的发生发展、预后以及了解肿瘤的治疗效果：1.正常人血中检出Kras基因异常，提示存在肿瘤易感性；2.良性肿瘤患者检出Kras基因突变,提示有恶变的可能；3.Kras基因突变阳性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高；4.《美国国立癌症综合网络》(NCCN)肿瘤临床指南及其中译版均明确指出：只有K-ras野生型患者才建议接受靶向药物的治疗，突变型患者不建议进行分子靶向治疗。5.检测Kras基因突变可筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。17增殖野生KRASEGFR西妥昔单抗细胞内细胞外细胞膜野生型K-ras野生型的EGFR通路K-ras突变型的EGFR通路CTGGTGCCG增殖突变KRASEGFR西妥昔单抗细胞内细胞外细胞膜突变型无效应！KRAS突变为活化突变，使增殖不受上游信号控制12、13(96%)和61密码子12号35GA(甘天门冬）为主CTGATGCCGKras基因是RAS超家族中的原癌基因，其编码蛋白的激活/失活受控于上游EGFR信号。单克隆抗体阻断EGFR和Kras蛋白等下游信号传导通路，抑制和逆转肿瘤的发生和发展。突变型Kras蛋白功能异常，无需EGFR活化信号刺激仍处于激活状态，且不可控而始终处于激活状态，导致肿瘤的持续增殖。对抗EGFR药物治疗无效。BRAF介绍及应用领域黑色素瘤概况•恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为3％～5％。2010年全球黑色素瘤新发病例199627例，死亡例数为46372例［1］。•虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，每年新发病例约2万例［1］。［1］CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(2011版)，临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期BRAF基因与黑色素瘤检测我国468例原发黑色素瘤标本，BRAF突变率为25,9％其中BRAFV600E是最常见的突变位点(87％)，这为中国患者使用BRAFV600E抑制剂(Vemurafenib)提供了理论基础［1］。B-raf基因V600E突变导致抗EGFR抗体或EGFR酪氨酸激酶抑制剂类肿瘤靶向药物的耐药。部分没有K-ras基因突变的患者也会对EGFR靶向药物产生耐药性，研究证明这主要是由于K-ras下游的B-raf基因V600E突变造成的［1］CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(2011版)临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期B-raf基因突变在多种恶性肿瘤细胞中都有报道，除了结直肠癌外，B-raf在恶性黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌、卵巢癌等均存在不同比例的突变。检测B-raf基因突变可用于指导EGFR-TKI的靶向用药谢谢