植物生物技术 愈伤组织的诱导继代及分化

植物愈伤组织的诱导、继代及分化专业：生化分子姓名：杨婷学号：1623120019主要内容第一节愈伤组织的诱导与继代培养第二节悬浮培养第三节愈伤组织的分化与植株再生第一节愈伤组织的诱导与继代培养一、愈伤组织的概念指植物受到机械、动物、微生物等伤害后，创伤部位的细胞脱分化而不断增值形成松散排列、无特定结构和功能的薄壁分生群。愈伤组织培养已被广泛的用于植物突变体筛选、植物细胞转化以及无性快速繁殖等方面的研究。同时，未分化愈伤组织也是植物细胞悬浮培养及原生质体分离和培养主要的材料来源和良好的遗传转化系统。二、愈伤组织的诱导1、外植体的选择选择外植体要综合考虑以下几个因素:①大小要适宜，不宜太小。外植体的组织块要达到2万个细胞（5-10mg）以上才容易成活；②同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别；③植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量的愈伤组织；④不同物种相同部位的外植体其分化能力可能大不一样。总之，外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜。用于培养的外植体包括根、茎、叶、果实、子房、花粉、花瓣等各种器官或组织。2、外植体材料的消毒一般采用次氯酸钠，其能分解成为具有杀菌效能的氯气，然后就散失到空气中。使用时按1:10稀释，消毒时间以材料定，消毒后无菌水冲洗4-5次。0.1%氯化汞是一种令人满意的消毒剂，只是难以去除，故在消毒后必须用大量清水冲洗材料。在材料放入消毒剂之前，先在乙醇中漂洗一下，可以使材料表面弄湿，从而使消毒剂易于渗入并杀死微生物。3、培养基采用的培养基的基本成分相似，但对于不同植物，同一植物不同物种都要对培养成分作相应改动，尤其是激素的成分和浓度是极为重要的因素。一般选择盐浓度较高的培养基如MS，B5及它们的改良培养基来进行愈伤组织诱导效果较好。培养基中还原态氮（主要为铵态氮）含量高，有利于愈伤组织的诱导；高钙高磷组合的培养基有利于小麦愈伤组织的诱导、生长和再生。对大多数植物组织来讲，激素是愈伤组织培养基中不可缺少的组成成分。生长素，对于细胞分裂的诱导以及在其后的生长和增殖，都是必要的物质。细胞分裂素未必是必需的物质，然而，常常因不同的供试材料而异。4、诱导条件光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，在黑暗或散光条件下最好。分化、继代培养一般需光。此时光对器官的作用是一种诱导反应。温度：外植体接入诱导培养基后，一般采用25-28℃的恒温条件下培养。湿度：较大，以免引起培养基干缩。一般双子叶比单子叶植物及裸子植物容易；二倍体种子植物，无论茎、叶、花等皆易去分化，特别是形成层和薄壁细胞容易诱导愈伤组织。5、愈伤组织的形成从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈伤组织，大致经历三个时期：起动期、分裂期和形成期；起动期，又称为诱导期，是愈伤组织形成的起点。外植体已分化的活细胞在外源激素的作用下，通过脱分化起动而进入分裂状态，并开始形成愈伤组织。在诱导期，细胞的大小仍然和外植体时一样，因此外观上未见明显变化，但代谢活化了，细胞内一些大分子代谢动态已发生明显的改变，细胞正积极为下一步分裂进行准备。•分裂期:外植体切口边缘开始膨大，外层细胞通过一分为二的方式进行分裂，而中间的细胞不分裂。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大等。从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。这时组织细胞代谢十分活跃，发生了一系列生理生化及形态的变化。•愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。•形成期:是指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期。这个时期特征是细胞大小不再发生变化，结构的形成过程加速，愈伤组织表层的分裂逐渐减慢和停止，为次生生长所代替，大量次生结构出现。在这时期中细胞的伸展和分裂处于平衡，故细胞的平均大小往往没有变化。内部组织细胞开始分裂，细胞数目进一步增加。愈伤组织的特征：生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。三、愈伤组织的继代培养和生长特性愈伤组织的继代培养愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基上以保持培养物的继续正常生长，更换一次培养基称一代继代培养。1、为什么要进行继代培养？•经过诱导培养一段时间后，培养基里的养分耗尽•培养基已干燥•生长物已充满培养瓶•培养物需要扩繁•琼脂培养基褐化或发黑（因为植物组织在培养前几周有时会产生毒素物质，这些物质会扩散进入培养基）•需要让培养物在一种新的营养条件下生长•培养基由于植物材料的原因使pH降低，导致培养基液化•理论上愈伤组织是可以无限制继代，但愈伤组织继代次数增加，形态发生能力逐渐丧失。2、愈伤组织继代培养方式•继代培养培养分为固体和液体培养两大类。•液体培养又分静止和振荡培养的二类。愈伤组织在液体培养基中培养应符合：（1）三角烧瓶容纳的培养基占总容积的20%～30%，培养基含量可随培养物量的减少而减少；（2）转速一般为80～100r/min；（3）细胞或愈伤组织的生长呈典型的S型曲线，即延滞期（lagphase），对数生长期（logphase），然后逐渐减慢，直至停止。3、愈伤组织的生长特性一般情况下，25℃下培养的愈伤组织需要每4~6周继代一次。大多数研究工作表明，对30ml培养基中愈伤组织每28天继代一次可以获得一个保持长期分裂状态、细胞基本均一的稳定群体。第一次继代培养时用无菌刀片将新鲜愈伤切下，无菌地转入新鲜培养基上，被转移的愈伤小块不宜过小，否则生长会受抑制。一旦愈伤建立起来，多数愈伤系需要每月继代一次。继代时般情况下不需改变原培养基的成分，但很多物种需要将生长素降低些，尤其是使用2，4-D时。一般地，经过继代培养的愈伤组织在稳定生长1～2代后，具有S型生长曲线。开始一周生长缓慢，中间3周生长很快，4周以后生长又变迟缓。第二节悬浮培养悬浮培养:一般是把一些小块生长旺盛的愈伤组织放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体。愈伤组织通过悬浮培养能产生大量的比较均一的细胞，而且细胞增殖速度快，适宜进行大规模细胞的培养。悬浮培养的用途•提供一个相对一致的细胞群体（供生化研究、胚胎发生研究、胚的同步化研究等）•能快速吸收外源物质，检查药效•研究次生代谢、酶诱导、基因表达、抗生素的降解的良好实验体系•多数悬浮细胞缺乏叶绿体、色素，对酶和次生物质的分离及纯化十分有利•细胞增殖速度快，适于进行大规模培养•分离原生质体的良好细胞来源第三节愈伤组织的分化与植株再生将愈伤组织转入分化培养基中，它可以再生分化完成形态发生而产生芽根结构的分生组织或胚状体。继之，由这些有结构的组织发育成完整的小植株。植物组织细胞离体培养中的形态发生可通过器官发生和体细胞胚胎发生这两种途径形成再生植株。体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的生产。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以同合子胚一样发育成植株。器官发生：指从愈伤组织形成芽及根的过程，芽及根是一个单极性结构，物理地同母体组织联结着。一、器官发生与植株再生方式在适合的激素浓度和配比及温光条件下，愈伤组织细胞会发生生理代谢上的改变，促使细胞分裂部位和方向改变，首先出现分生细胞，经细胞分裂逐渐形成分生细胞团和分生组织，进一步再分化形成维管结节直至分化成芽和根等器官。可以把愈伤组织分化出芽、根器官概括为以下几种方式：⑴单极分化：愈伤组织中的分生中心在刺激物质的影响下向着一极分化，形成有根无芽或者有芽无根的现象。⑵双极分化：愈伤组织中随着细胞分裂出现两个或两个以上分生中心，其中有的分化芽，有的分化根，根芽之间并无输导等组织沟通，在培养瓶内靠愈伤组织提供养料，这种以愈伤组织隔离着的芽和根的苗，常常不能移栽成活。⑶先芽后根：愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心，从中仅分化出芽，一般情况下待芽长到一定大小时，切下移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。有些植物在分化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多数植物均属这类正常的分化途径，这类苗移栽较易成活。⑷先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分化出根，而后在靠近愈伤组织的根部上再分化出芽，有的将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至在根端也能分化出芽。影响器官发生的因素1、化学因素:高浓度的生长素和低浓度的分裂素可以促使细胞连续繁殖—无组织的生长。高浓度的分裂素能引起茎-芽形成。生长素促进根分化，分裂素促进芽分化。2、物理因素光：光照条件下,一些植物均能进行器官发生，说明光周期并不是非常重要的因子，可有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而在连续光照下则不能。尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期，多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗。光质对于某些植物可能也很重要。温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉花就不一样。3、外植体的生理状态和成熟及高度分化的细胞相比，由分生细胞和胚细胞产生的愈伤组织具有较高的再生能力。外植体的个体发育年龄和部位、大小。4、培养物的年龄愈伤组织在增殖培养基上生长过久，致使组织衰老后移至分化培养基上，往往会推迟器官的分化。二、体细胞发生与植株再生在离体组织细胞培养形成胚状体的过程中，体细胞分裂增殖并顺序通过原胚期，球形胚期，心形球形胚期心形胚期，鱼雷形胚期和子叶期五个时期，进而形成完整的植株的过程。与整体植物中受精卵的发育过程极为相似。（一）、植物胚状体发生的普遍性由于培养的植物组织细胞一般是体细胞，因而将由离体培养的组织细胞分化出的胚叫体细胞胚；由于离体培养的植物组织细胞是在未经过有性过程的情况下直接产生胚这一结构，并且形成的胚与性细胞形成的胚相似，因此也将此类胚称为胚状体。（二）、胚状体的概念与分类胚状体:是植物组织培养中起源于非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构。这个定义包括下列几点含义：①胚状体是组织培养的产物，只限于组织培养范围使用，区别于无融合生殖的胚；合生殖的胚；②胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚；③胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于组织培养中分化的芽。无融合生殖：是不经过雌、雄性细胞融合直接由营养体细胞或未进行减数分裂的大孢子母细胞发育成的无性胚或无性种子，这种无性胚或无性种子具有保持杂合性的特点，因而能够固定杂种优势。胚状体按其来源分为两大类一类是由普通植物体（孢子体）的各种器官等双倍体的体细胞产生的胚状体，也称之为体细胞胚；一类是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，通常称为花粉胚，可发育成单倍体植株。不管是那种类型的胚状体，它都有两个特点：①两极性，即在其发生的最早阶段就具有根端（胚根）和茎端（胚）；②它与母体植物或外植体的维管束系统无直接连系。植株再生通过胚状体与器官两种途径的主要区别胚状体途径形成的植株器官途径形成的植株细胞内出现方向相反的两级分化，具有根端和芽端两个分生中心单向极性，单个分生中心不定胚维管组织与外植体维管组织不相连，是独立“Y”字型结构不定芽和不定根与愈伤组织的维管相连无胚胎形态，分生中心直接分化为器官具有典型的胚胎形态发生过程形成的幼苗具有子叶不定芽的苗无子叶胚状体发育的苗，根和芽齐全一般先长芽后长根，或先长根后长芽影响胚状体发生和发育的外部条件1、植物激素（1）生长素类物质在对胡萝卜胚状体的发生研究中发现，其胚状体的发生可分为两个阶段：第一阶段包括外植体细胞的脱分化、愈伤组织的诱导、胚性细胞或细胞团的形成，这一阶段所用的培养基必须含有生长素类物质，主要是2，4-D；第二阶段包括胚状体的形成和发育，这一阶段必须在降低2，4-D浓度或完全去除2，4-D的培养基上才能进行。(2)细胞分裂素类物质细胞分裂素不仅没有诱导的作用(单独使用不能诱导愈伤)，而且对已完成诱导的愈伤组织中胚状体的发生还有抑制作用。但在除去细胞分裂素之后，胚状体发生能力还可能部分地恢复。（3）生长素与分裂素结合使用多数情况下多数情况下，生生长素与细胞分裂素结合使用在植物胚状体诱导中有正效果。（4）其它激素一般ABA、GA抑制胚状体