化学药物结构确认

化学药物结构确认研究的技术要求结构确证的一般过程•研究方案的制订•合格样品的制备•结构信息的获取•综合解析药物结构的分类•一般药物•手性药物•不含金属元素的有机盐类或复合物•金属盐类和络合物•半合成药物•多晶型药物•含有结晶水或结晶溶剂的药物•合成多肽药物和多糖类药物•多组份药物•其他一般药物•范围：非手性、单一结构、非多晶型的一般有机药物•研究方法：采用常规方法（元素分析、紫外、红外、核磁、质谱、热分析、粉末X-衍射）•注意事项：对于顺、反异构的药物，在一般结构确证的基础上，应增加顺反结构的研究。手性药物•药物的生物活性完全或主要由其中一个对映体产生•两个对映体具有完全相反的生物活性•一个对映体有严重的毒副作用•两个对映体的生物活性不同•两个对映体具有完全相同的生物活性手性药物分类•单一对映体药物•多不对称因素药物•立体异构混合物•外消旋体或富集对映体单一对映体药物•绝对构型的确定：•直接方法：比旋度测定、手性柱色谱、核磁共振、单晶X-衍射、圆二色谱、旋光色谱•间接方法：根据已知的起始原料构型、化学合成方法的立体选择性以及中间体的结构也可简接获得终产品（药物）的构型信息。立体异构混合物•需进行各立体异构体比例的确证研究•对于已有实验证据或文献报道立体异构体在药效、药代动力学、或毒理等方面有明显不同或有相互作用的药物，更有必要测定混合物中各组分的构型和比例。不含金属元素的有机盐类或复合物•研究要点：•根据结构确证的需要，可提供成盐前后的两套波谱和实验数据•对于某些波谱测定有困难或不易说明药物结构的盐或复合物，测定药物的酸根或碱基的波谱，并结合其它试验项目亦可对其结构确证提供有效的信息。金属盐类和络合物•在进行一般要求的各项测试基础上，考虑以适当手段反映药物中金属元素的种类，存在形式和含量的确证实验。•适于或不能测试金属盐本身的项目，可考虑以成盐前的酸分子或配位体的相应测试结果进行佐证。多晶型药物•同一药物的不同晶型在外观、溶解度、熔点、溶出度、生物有效性等方面可能会有显著不同，影响了药物的稳定性，生物利用度及疗效。尤其是难溶性固体药物。•研究要点（1）在进行一般要求的各项测试基础上，应以适当方法获得药物晶型数据。（2）目前鉴别药物晶型主要是针对不同的晶型具有不同的理化特征及光谱学特征来进行的。特征性强，区分度高是选择分析方法的基本要求。药物晶型测定常用方法•（1）单晶X-衍射共认的最可靠的方法）（2）粉末X-衍射常用方法•（3）辅助性方法（红外吸收光谱、熔点、热分析、光学显微镜）仿制的多晶型药物•（1）明确药物晶型的类型和纯度•（2）对于混晶药物，应测试其晶型组成，并与文献数据比较。应确证自制品与国外上市药品晶型的一致性。合成多糖类药物•确定氨基酸的种类和序列•药物结构中如有半胱氨酸，应明确其状态（氧化态或还原态）•对含有多个半胱氨酸的多肽药物，应明确二硫键的正确连接位点。多组份药物•明确各组分的组成比例，对影响药效和毒性的主要成分进行结构确证。•可使用经典的提取方法或其它分离技术，如制备色谱，分离得到主要药效成分单体，按单体项目要求进行化学结构确证。•在组分多，含量少，难于得到单体时，可使用联机分析技术，如气-质连用，液-质连用，质-质连用，辅助组分结构的验证及定量分析。合格样品的制备测试样品的要求纯度：99.0%杂质含量：0.5%样品的精制方法采用原料药制备工艺中产品的精制方法对样品进行精制。纯度的测定采用质量标准中的方法测其纯度和杂质对照样品•已知药物根据具体情况，采用不同的方法得到。•全新药物或不易得到对照品的药物•对照品并非确证结构时所必须的，有对照品只是能减少我们结构确证研究的工作量及难度。元素分析•主要应用确定元素组成、分子式•技术要点（1）应详细说明使用仪器、测定方法及条件。（2）一般测试C，H，N三种元素，特殊情况下还需要测试S，P或卤素。（3）要有2~3次平行的试验数据，测试结果与理论结果的差值一般要求在0.3%之内。（4）附测试报告单的复印件。（5）对个别特殊样品要注意结晶水、吸水或高沸点溶剂的情况。可以含有不同数量的水或溶剂，如季铵盐类药物，多数情况下容易吸水。高分辨质谱（HRMS)•主要应用对于因药物自身结构特征而难于进行元素分析时，在保证高纯度情况下可采用高分辩质谱方法，是对元素分析方法的补充。•实验要求：测试结果与理论值比较，药物的分子离子峰一般只允许小数点后第4位可以有误差。紫外吸收光谱•主要应用推测药物结构中可能含有的发色团，助色团种类以及初步的连接方式。•技术要点•（1）按药典规定方法校正和检定仪器。（2）通常要求三种溶剂：中性、0.1NHCL、0.1NNaOH；（3）要求定量、准确计算摩尔吸收系数；（4）归属主要吸收谱带；（5）数据列表说明。红外吸收光谱•主要应用•推测药物中可能存在的化学键、所含的官能团及其初步的连接方式。•提供药物的几何构型、晶型、立体构象等信息。技术要求•按药典规定方法校正和检定仪器•正确选择测试条件和方法•固体药物：首选溴化钾压片法•部分多晶型药物：研磨和压片过程中晶型可发生变化-------糊法•液体样品：液膜法资料撰写格式•仪器•测试条件•仪器校正和检定•数据表•解析吸收峰振动类型基团吸收峰强度核磁共振谱•常用类型：氢核磁共振谱和碳核磁共振谱•氢核磁共振谱：可提供供试品中氢原子数目、周围化学环境、相互间关系、空间排列等信息。技术要求•技术要求（1）应使用200MHz以上高分辨NMR仪（2）对各项测试条件应有明确、详尽的说明，如仪器型号、规格、溶剂、内标。（3）对分子中全部H原子要有明确的解析和归属。（4）重要参数要清晰显示：化学位移、偶合常数、峰形、积分面积等。（5）氘代实验：对含有活泼氢的药物必须进行氘代实验，以提供活泼氢的存在以及位置的信息。（6）NOE实验可给出某些官能团在分子中的位置、优势构象及构型。资料撰写格式•仪器•溶剂、内标•给出原子编号结构式•数据表•解析原子序号化学位移质子数多重性相应质子核磁共振碳谱•技术要求：（1）对各项测试条件应有明确、详尽的说明，如仪器型号、规格、溶剂、内标。（2）在图谱复杂时，应使用质子噪声去耦或偏共振去耦技术，使图谱简化。（3）对分子中全部碳原子要有明确的解析和归属。资料撰写格式•仪器•溶剂、内标•给出原子编号结构式•数据表•解析碳原子序号化学位移碳原子类型碳谱注意点•碳谱信号数目比实际的少，原因可能为信号重叠、或有些季碳信号弱，或隐藏在溶剂信号内；•碳谱信号数目比实际的多，原因可能为某些化合物存在构象异构其它核磁共振谱•DEPT谱：可区分碳原子的类型•H-HCOSY：可以显示相隔2~3键相互之间存在偶合的质子对信息。•HSQC（异核单量子相关谱）把1H核和与其直接相连的13C核关联起来。•HMBC（异核多重键相关谱）把1H核和远程偶合的13C核关联起来。质谱•主要应用：提供分子离子峰、碎片峰、丰度等信息，可以确定分子量、分子式以及推测部分结构单元。对含有同位素元素的药物，利用同位素簇的丰度比，可推断药物中部分元素的种类、数量，乃至分子式、裂解方式等。技术要求•应尽量设法获得化合物分子离子峰。当用EI法不能出现分子离子峰时，可试用其它电离源，如CI，FAB，FI，FD，ESI。•高分辩质谱不能反映药品的纯度和结晶水，结晶溶剂，残留溶剂的情况。资料撰写格式•仪器•测试条件•数据表•裂解图•解析M/Z相对丰度碎片离子X-射线衍射•粉末X-射线衍射（XRPD)•主要应用（1）固态单一化合物的鉴别（2）晶型确定（3）晶态与非晶态物质的判断•技术要点该方法不必制备单晶，使得实验过程更为简便，但在应用时应注意粉末的细度，而且在制备样品时需特别注意研磨过筛时不可发生晶型的转变。单晶X-射线衍射•主要应用该方法是公认的确证多晶型的最可靠方法，但由于单晶的培养比较困难，在实际操作中存在一定困难。热分析方法•基本原理采用程序控温下，精确记录待测物质理化性质与温度的关系，研究其受热过程中晶型转变、熔融、升华等物理变化和脱水、热分解、氧化、还原等化学变化。•常用方法差示扫描量热法（DSC）：可推测出测试药物的吸附水/溶剂、结晶水/溶剂以及熔点等信息。•热重法（TGA）：可获得药物的吸附水/溶剂、结晶水/溶剂以及初步的分解温度等信息。技术要求•应说明使用仪器型号、参数设定值、包括升温速度、样品重量、温度范围。•供试品与对照品应在同一仪器，相同条件下测定。•DSC表达：纵坐标为热流率，横坐标为温度，气体一般为氮气，流速为40ml/min。•TGA表达：纵坐标为重量，横坐标为温度，气体一般为氮气，流速为40ml/min。资料撰写格式•仪器•测试条件•图谱•测试结果和讨论•【溶解度】会因结晶溶剂的不同导致结果的差异性，一般不做硬性规定，酌情处理。只是操作时样品一定要研细后进行。同时对于贵重药物，成比例减小重量。•【晶型】如研究表明：各晶型具有相同表观溶解度，或者各晶型皆易溶于水，此时各晶型一般不会影响药物的体内生物利用度，便无需拟定。如各晶型具有不同表观溶解度，即有属于低溶解性的晶型，此时则应在质量标准中拟定晶型检测。一般采用X-射线衍射法。有时亦能采用红外予以明辨。•【红外鉴别】观测2500cm-1-400cm-1波数段间8大主峰波数。峰间高低可以不一。个别小峰允许存在，是杂质存在的体现。【荧光分析法】响应值不稳定，有时会波动较大，不建议使用。•【熔点测定法】试验结束后切勿立即切断电源，设置为室温，使其自然降温，之后再关闭电源。熔距越短或终熔点越接近高限、纯度越高。【紫外-可见分光光度法】比色法测定时、一定要平行操作，测定时迅即完成，切忌等待吸收度值稳定后再行记录！•【旋光度测定法】温控尤为重要！先将溶剂置于该温度水浴中，随后采用该溶剂快速配制溶液，定容后立即测定。【氧瓶燃烧法】样品一定要燃烧完全。若氧气充满、尚无法燃尽，可将样品量减半，在其后的测定中再将浓度增加一倍，即可。•【溶液的澄清度与颜色、氯化物、硫酸盐、重金属检查等】建议配制梯度对照液，这样可对样品进行一个全面、综合分析。【炽灼残渣检查法】炽灼后放置于干燥器内的时间不得少于1小时，否则称重不稳。【干燥失重和水分】•(1)一些缓慢降解的物质、不易采用恒重，规定时间。一般105℃、3小时肯定已可以！(2)带有结晶水的药物，尽量采用卡氏法测定。残留溶剂研究思路★研究原则：合成过程中使用到的有机溶剂均需建立测定方法、并予以研究测定。★观测样品测定结果：申报3批样品测定结果说明工艺稳定性。★质量标准拟定原则：除第一类溶剂外、“未检出的溶剂”可以不拟定，仅拟定最后一步重结晶溶剂。★测定方法：根据研究检测结果，质量标准方法完全可以与研究时方法不同。•★质量标准拟定原则：如仅残留有重结晶溶剂、且为低沸点（如乙醇、丙酮等），完全可采用105℃干燥失重方法予以替代。从而省略掉气相测定，且干燥失重限度可酌情放宽。高效液相色谱法应用时经常出现的问题※柱温箱一定要配制。试验温度建议在30-50℃。清洗温度可高于试验温度5℃。※色谱柱清洗：对于正相、实验结束用流动相再冲洗半小时即可。对于反相，除非流动相采用单纯的甲醇/乙腈-水，其他所有流动相皆建议先用纯水冲洗半小时（流速1.0ml/min），再改用20%甲醇冲洗半小时，随后取下、两头密闭即可。绝不推荐……※液相色谱仪：绝不建议为节约乙腈/甲醇，而采用两个泵，将水相与有机相分别注入混合的方式（即便配置了脱气机）。一定要将两相按比例混合后脱气过滤，采用一个泵注入。※过滤膜一定要采用混相膜。※正相流动相无需过滤、混合均匀后超声即可。高效液相色谱法应用时经常出现的问题※梯度洗脱时——最理想方式：A相位高比例的水相兑低比例的有机相；B相为低比例的水相兑高比例的有机相；其次：A相位高比例的水相兑低比例的有机相；B相皆为有机相。绝不建议A相位纯水相、B相位纯有机相，即便质量标准如此拟定，采用一元一次函数，将其转换成第二种情况，否则极易出现基线飘动、无法准确积分的现象。高效液相色谱法应用时经常出现的问题※梯度洗脱时，必须先行测定空白溶剂峰，应基线平稳、溶剂