定量与常规PCR的差别

东胜创新技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析三个关键词：实时，定量，荧光东胜创新仪之如何定量？Ct值的概念•Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。为什么要用Ct值定量•实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。东胜创新定量原理初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新SYBRGreen1MolecularBeaconsTaqMan荧光化学Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新AmplifluorRoche荧光化学Opticon实时荧光定量PCR仪之阴阳探针R1R2RQ东胜创新仪之SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA东胜创新变性:无荧光信号SYBRGreenI工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新应用范围起始模板浓度定量融解曲线分析---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体基因型分析Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新优点使用方便---不必设计复杂的引物没有序列特异性---可以用于不同的模板便宜灵敏Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新缺点与非特异性产物结合Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新原理：荧光谐振能量传递（FRET）茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎Opticon实时荧光定量PCR仪之荧光素淬灭剂环东胜创新变性:产生非特异性的荧光TACCGGGGGTTACGAACGGTAATTACCGGGGGTTACGAACGGTAATMolecularBeaconsOpticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新延伸:没有荧光MolecularBeaconsSNPOpticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新应用范围定量起始模板浓度基因型分析鉴定产物单核苷酸多态性（SNP）检测Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新优点对目标序列有很高的特异性用于SNP检测的最灵敏的试剂之一荧光背景低Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新缺点设计困难无终点分析功能只能用于一个特定的目标价格较高Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新仪之退火:无荧光信号3’3’5’5’模板和探针杂交东胜创新延伸:聚合反应5’5’3’3’TaqMan工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新’3’5’5’延伸:Taq酶切下5’端荧光素出现荧光TaqMan工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新应用范围定量起始模板浓度基因型分析产物鉴定SNP分析Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新优点对目标序列有很高的特异性---特别适合于SNP检测与MolecularBeacons相比设计相对简单Opticon实时荧光定量PCR仪之东胜创新的小沟中发夹型杂交探针水解型杂交探针（5‘-3’外切）延伸复性任何步骤定量和检测目标基因融解曲线分析SNP分析定量和检测目标基因SNP分析定量和检测目标基因信号检测工作原理有否淬灭剂化学试剂否有有主要应用范围Opticon实时荧光定量PCR仪之