普通显微镜

显微镜技术张文博15692165023上海海洋大学水产与生命学院主要内容一、显微镜的发展二、显微镜的应用三、显微镜的原理四、显微镜的结构五、显微镜的重要参数六、显微镜的镜头七、显微镜的像差一、显微镜的发展显微镜理论、制作和应用的发展——从十五世纪开始逐渐发展起来的。近代光学显微镜的发展历程1590年，荷兰的詹森父子(HansandzachriasJanssen)制造出第一台原始的、放大倍数约为20倍的显微镜这个显微镜是用一个凹镜和一个凸镜做成的，制作水平还很低。发明的偶然性詹森父子俩的修养起了决定作用，他们抓住这个偶然的发现，认真思索，反复实践，用大大小小的凸玻璃片做各种距离不等的配合，终于发明了世界上第一台显微镜。并没有发现显微镜的真正价值。也许正是因为这个原因，詹森的发明并没有引起世人的重视。16l0年，意大利物理学家伽利略(Galileo)制造了具有物镜、目镜及镜筒的望远镜1665年，英国物理学家罗伯特·胡克(RobertHooke)用复式显微镜观察软木塞时发现了小的蜂房状结构，称为“细胞”，由此引起了细胞研究的热潮。（左）1665年R.Hoock用来发现细胞的光学显微镜。(右)1848年的显微镜。近代光学显微镜的发展历程荷兰的显微镜学家、微生物学的开拓者列文虎克(A.vanLeeuwenhoek)首先制造成放大275倍的显微镜，并于1673年，描述了哺乳动物红血球的观察情况，1677年，又发现了人以及狗和兔子的精子MadebyA.vanLeeuwenhoek(1632-1723).Magnificationrangesat50-275x.近代光学显微镜的发展历程1684年，荷兰物理学家惠更斯(Huygens)设计并制造出双透镜目镜－惠更斯目镜，是现代多种目镜的原型。这时的光学显微镜已初具现代显微镜的基本结构惠更斯目镜有两片凸面朝向显微物镜的内焦点平凸透镜构成,该结构不能消场曲,由像散来平衡,一般用于低倍显微镜;1752年，英国人J.Dollond发明消色差显微镜。1812年，苏格兰人D.Brewster发明油浸物镜，改进了体视显微镜。1840年法国光学仪器商人查尔斯·塞福尔制造的显微镜MicroscopemadebyCharlesChevalier1840在显微镜的发展史中，贡献最为卓著的是德国的物理学家、数学家和光学大师恩斯特·阿贝(ErnstAbbe)。他提出了显微镜的完善理论，阐明了成像原理、数值孔径等问题，在1870年发表了有关放大理论的重要文章。两年后．又发明了油浸物镜，并在光学玻璃、显微镜的设计和改进等方向取得了光辉的业绩。Bausch&LombInvestigatormicroscope–circa1893显微镜的发明使人类更深刻地揭示了自然界的奥秘，推动了各学科的发展，反过来由于科学的发展，又促进了显微镜技术的改进，使之日趋完善。显微镜设计与制造现代多为光、机、电的三结合体。现代显微镜1932年，荷兰籍德国人F.Zernike成功设计了相差显微镜（phasecontrastmicroscope)，并因此获1953年诺贝尔物理奖。现代光学显微镜的发展历程1932年，德国人M.Knoll和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。TEM1981年，瑞士人G.Binnig和H.RoherI在IBM苏黎世实验中心（ZurichResearchCenter）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。Csatoms(red)ontheGaAssurface(blue).二、显微镜的应用显微镜的作用——是一种处理波的工具，是处理可见光及近可见光波段的波，使之成束地照射在被检物体上。其成象落在人眼的视网膜、感光片或其它记录系统(如电视显示或电影)上，突破了人类生理的限制。把视觉伸展到人眼不能分辨的微观世界中去。用来观察、记录和研究经过制片技术处理后的被检物体的细微结构。对微观世界的探索及理论上的研究起着极其重要的作用。广泛地应用于各学科的领域中。光镜技术在生物学上的应用A观察活细胞的形态结构，生命运动，细胞周期。B细胞器的定位及功能研究。C基因产物与大分子物质的定位及定量。D监测细胞代谢活动。细胞的钙信号引起钙依赖水母发光蛋白发光罗丹明123染色后显示的细胞线粒体的定位三、显微镜的原理光具有的物理性质折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，二点之间应以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则会发生折射现象，这是由于光在不同介质中的传播速度不同所造成的。不同介质的折射率空气——1.0水——1.33甘油——1.405光线经过不同介质发生折射，造成像的放大缩小人眼的重要性——人眼具有敏捷的性能，视觉传入大脑的信息约占各种信息的80％，其高度的准确性、灵敏度、分辨力和适应性等方面，至今在理论上尚未完全解释清楚。人眼的局限性——不能看清很远或太小的物体。对所观察到的物体的形状、大小和远近，不能作出精确的定量比较和计量。对发生在瞬间的现象或事物不能留下长久的记录。只能感受光谱中很窄的可见光（波长约为400-700毫微米）范围内的电磁波。光学显微镜的组成均由单个和多个透镜组成，即由物镜、目镜及聚光镜等部件。透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学原件。透镜依其外形的不同可分为两大类1、凸透镜（又称会聚透镜、正透镜）2、凹透镜（又称散发透镜、负透镜）透镜成象凸透镜——在物方所成的象是光线真正的交点，称为“实象”。实象——在屏幕上能显现出来，而虚象则不能，但当我们用眼睛对着透镜观察时，则完全能看到它。凹透镜所形成的象是与物体处在同一方，称为“虚象”。虚象——当一束平行于光轴的光线通过凹透镜后，形成散射光，在象方空间不能相交于一点，只有它们的延长线才能在物方空间相交于一点，这个点称“虚焦点”，这个平面称“虚焦点平面”。FOFFOF显微镜的成象原理当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象；当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。放大倍数＝物镜倍数*目镜倍数250mm明视距离四、显微镜的结构照明系统包括光源、聚光器光学放大系统由物镜和目镜组成机械装置用于固定材料和观察方便照明系统包括光源、聚光器物镜:是决定显微镜的质量、分辨力和放大倍数的最关键部件;在物镜筒壁上常注有主要性能指标——放大倍数、镜口率等;目镜:是由上面的接目透镜和下面的会聚透镜二部分组成的,两者之间装有一个光阑;光学放大系统:镜座是显微镜的基座,用以支持整个显微镜,其内常装有照明光源和反射镜;镜臂是显微镜的主要支架,用以支持镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等;载物台又称镜台,中央有一个通光孔,确保光线与台面垂直通过。镜筒位于镜臂的上部,其上端放置目镜,下端连接物镜转换器;调焦装置包括较大的粗准焦螺旋和较小的细准焦螺旋;物镜转换器等机械装置：用于固定材料和观察方便,包括:五、显微镜的重要参数显微镜的重要参数分辨率放大率和有效放大率数值孔径焦深视场宽度复盖差工作距离图像亮度视场亮度合理使用参数各项参数并不都是越高越好，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调各参数之间的关系，以保证分辨率为准。分辨率（Resolution）又称“鉴别率”、“解象力”和“分辨本领”.是指将邻近两点清晰区分辨认的能力。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。分辨本领：德国著名理论光学家Abbe早在100多年前就给出分辨本领：R=0.61λ/nSinα，n为物体所处媒介的折射率；α为孔径角；λ为发射光波长。衍射的形成物理光学把光视为一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和粒子性。由于光具有波动性质，使得光波相互之间发生干涉作用，产生衍射现象。狭缝实验屏幕上的P1点到狭峰上边缘的距离和它到狭峰下边缘的距离之差为一个波长。从狭峰上缘和从狭峰下缘发出的两列光波在P1点相互影响。整个狭峰内发出的光波的累计相干效果，是在P1点两侧造成一个光强的低谷，P1点位于谷底位置。相反，在P2点处，从狭缝上缘和下缘发出的光波的波程差1½个波长，P2成为相干增强区的中心，称为第一级衍射极大值。衍射结果点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径式中n为介质折射率，λ照明光波长，α透镜孔径半角，说明埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜数值孔径成反比．sin61.00nR由斑点光源衍射形成的埃利斑（a）及其光强分布图（b）衍射使物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，它们将无法被区分开来。瑞利判据：两埃利斑中心间距等于第一暗环半径Rsin61.00nR阿贝成像原理对于周期性结构的物体，图像的形成用阿贝成像原理来解释。光线通过细小的网孔时要发生衍射，衍射光线向各个方向传播，凡是光程差满足k=0，1，2，…的，互相加强。同一方向的衍射光则成为平行光束。平行光束通过物镜在后焦面上会聚；形成衍射花样。衍射花样上的某个衍射斑点是由不同物点的同级衍射光相干加强形成的；同一物点上的光由于衍射分解，对许多衍射斑点有贡献。从同一物点发出的各级衍射光，在产生相应的衍射斑点后继续传播，在象平面上又相互干涉，形成物象k阿贝成像原理阿贝成像原理可以简单地描述为两次干涉作用：平行光束受到有周期性特征物体的散射作用形成衍射谱，各级衍射波通过干涉重新在像平面上形成反映物的特征的像。物与象之间的相似性物象是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让衍射光通过就不能成象，参与成象的衍射斑点愈多，则物象与物体的相似性愈好。分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。R=0.61λ/N．A．λ为入射光线波长；N．A．为镜口率＝ｎsinα，n=介质折射率；α=镜口角/2（样品对物镜镜口的张角/2）思考：如何提高显微镜的分辨能力？肉眼：0.2mm;光镜：0.2um;电镜：0.2nmsin..nAN..61.0ANR对可见光（波长为400~700nm）来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔为0.2m。R＝0.61/n.sina＝0.61×0.5m/1.5×1＝0.2m表:几种介质的折射率介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66sin..nAN..61.0ANR显微镜的几个光学特点：分辨本领是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定，NA值越大，照明光线波长越短，分辨率就越高。介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好；sinα的最大值小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。sin..nAN..61.0ANR放大率的概念放大率即为放大倍数,是指被捡物镜经物体放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值。是物镜和目镜放大倍数的乘积。是指长度的放大，而不是指面积的放大。物镜和目镜的放大倍数均标刻在其外壳上。总放大率(M)＝物镜放大率(Mob)x目镜放大率(Moc)放大倍数＝物镜倍数*目镜倍数有效放大率把由显微镜的分辨本领所能分辨开的两点间的距离，放大成相当于人眼能分辨的距离。人眼的分辨本领大致为0.1mm,所以分辨本领为0.2μm的显微镜，其有效放大率是0.1×1000/0.2=500倍。无效放大率当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。显微镜观察物体时，把物体的像放大到超过肉眼已能详细辨认细节的程度是没有必要的。普通光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.1mm，因此,光学显微镜的有效放大倍数为0.1mm/200nm=500倍左右在实际使用时